[发明专利]用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条技术，用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒。

背景技术

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella mutocida，Pm)是引起多种畜禽巴氏杆菌病的革兰氏阴性病原菌，一般寄生于动物的上呼吸道，具有条件致病性，在某些应激条件刺激下，可引起带菌动物发生以出血性败血病或呼吸系统疾病。家畜中以牛、猪、兔、绵羊发病较多，山羊、鹿、骆驼、马、驴、犬、猫和水貂等亦可感染发病。禽类中以鸡、火鸡和鸭最易感，鹅、鸽次之。根据荚膜抗原的特异性，可将Pm分为5个血清型(A、B、D、E、F)。在我国，引起禽和猪巴氏杆菌病的主要病原是荚膜血清A型Pm，引起牛的主要为荚膜A型和B型Pm，荚膜A型主要表现为牛纤维素性化脓性肺炎，荚膜B型主要表现为牛出血性败血症。由于Pm可以在同种或不同种动物间互相传染，对养殖业危害严重。

多杀性巴氏杆菌病的病原学诊断方法主要有细菌的分离培养、生化鉴定、动物回归试验等，这些方法费时、操作繁琐、准确率低，不适合临床快速诊断的需要。近年来PCR方法已经大量应用在巴氏杆菌病的诊断中，根据多杀性巴氏杆菌保守基因设计引物，可以诊断荚膜A、B、D、E和F 5个血清型。但由于PCR方法需要特殊的仪器设备和专业的技术人员，在基层条件差和技术人员匮乏的情况下，现场实地快速诊断很难实现。此外，现有的采用PCR诊断多杀性巴氏杆菌的报道中，其设计引物所依据的保守基因序列有多种，有的以多杀性巴氏杆菌毒素基因(toxA)作为保守序列设计引物(CN104073567A)；有的以多杀性巴氏杆菌的的PlpB基因作为靶基因设计引物(“猪多杀性巴氏杆菌环介导等温扩增检测方法的建立”，中国预防兽医学报，2014年12月)，而根据不同的靶标(保守基因)设计的引物序列不同，对巴氏杆菌的诊断和检测效果也存在较大差异，因此，选择何种靶标作为引物设计的依据也是PCR诊断多杀性巴氏杆菌的难点之一。

LAMP技术虽然可以进行核酸的恒等温扩增，但由于它的反应温度在60℃-65℃，反应时间在30-60min，仍然不能在常温下进行，并且不能对核酸粗提物的DNA样本进行直接扩增。因此，从诊断的时效性方面考虑，亟需一种可用于现场恒等温条件下的简易核酸检测技术。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是目前新出现的一种体外快速核酸扩增技术，在37℃左右就能发生反应，并且仅需十几分钟就能扩增出痕量级的检测产物。同时RPA可以完成核酸粗提物的扩增，它可以通过琼脂糖凝胶电泳，荧光扩增曲线和侧流层析试纸条(Lateral Flow Dipstick，LFD)三种方式检测结果，这三种方式的引物与探针反应原理是不同的。基本的RPA扩增只需上下游引物，产物通过凝胶电泳检测，而RPA-nfo和RPA-exo反应，是通过不同的探针结合到模板互补链后再通过核酸内切酶IV(nfo)和核酸内切酶III(exo)切割掉3'端阻止序列，这两种方法分别通过LFD(nfo)和实时荧光(exo)两种不同的手段检测结果。凝胶电泳和荧光扩增曲线法仍然依赖实验室和特殊仪器设备，而LFD是一种无需特殊仪器可用于现场的检测方法。将RPA技术与LFD技术结合，通过LFD读取结果，既不要求特殊仪器设备，也无需复杂的样品处理，借助恒温水浴锅用LFD就可以通过肉眼观察结果。

但RPA技术属于新兴的核酸扩增技术，其应用并不十分普遍，其主要技术难点在于特异性引物和探针的设计和筛选，而引物/探针的设计和选择对RPA-nfo的结果是至关重要的，目前并没有像PCR扩增技术那样专门的引物/探针的设计软件，也没有较多的文献和试验数据提供技术依据。经相关检索，目前还未有针对多杀性巴氏杆菌进行RPA-LFD检测的相关报道。

综上，对于多杀性巴氏杆菌的RPA-LFD检测，目前尚无明确可借鉴的思路和结果，还需要技术人员做大量和深入的研究。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针；其RPA-nfo正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示，其RPA-nfo探针序列如SEQ ID NO.3所示。

具体序列如下：