[发明专利]用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.一种用于现场快速检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针组合，包括RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针，其特征在于，所述RPA-nfo正向引物、反向引物和RPA-nfo探针的序列如下所示：

正向引物：5'-TTGCCGCGAAATTGAGTTTTATGCCACTTG-3'；

反向引物：5'-(Biotin)AATAACGTCCAATCAGTTGCGCCGTTGTCA-3'；

探针：5'-(FAM)ATGGCATTATTTTATGGCTCGTTGTGAGTG(dSpacer)GCTTGTCGGTAGTCTT(C3-Spacer)-3'。

2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备多杀性巴氏杆菌检测的试剂盒、芯片和/或扩增反应试剂中的用途。

3.一种检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含权利要求1所述的引物和探针组合。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中还包括有：阳性质控标准品、阴性质控标准品和RPA-nfo反应液。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控标准品为包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品；

优选的，所述的包含多杀性巴氏杆菌Kmt1基因片段阳性质控标准品，由含有192个碱基的核苷酸片段构成的pEASY-T3重组质粒组成；

所述含有192个碱基的核苷酸片段的序列如SEQ ID No.4所示。

6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控标准品为pEASY-T3空载质粒。

7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA-nfo反应液，包括下述试剂中的至少一种：

recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、rehydration缓冲液、280mM醋酸镁溶液、侧流层析试纸条、LFD检测缓冲液、灭菌去离子双蒸水，TE缓冲液、SDS、蛋白酶K和多杀性巴氏杆菌标准阳性模板。

8.一种非诊断目的的检测多杀性巴氏杆菌的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)检测样本DNA的提取或检测样本的现场裂解处理；

(2)以步骤(1)中处理的样本为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合进行RPA-nfo扩增；

(3)用LFD检测上述RPA-nfo扩增产物，根据检测结果判定样本中是否含有多杀性巴氏杆菌。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RPA-nfo扩增体系为25μL：其中包括1.0μL的正向引物，1.0μL的反向引物，0.3μL的探针，rehydration缓冲液14.75μL，待测样本DNA或粗裂解产物2μL，ddH₂O 4.7μL；将上述23.75μL混合物加入RPA-nfo反应管，充分混匀、溶解，最后加入280mM的醋酸镁溶液1.25μL，上下颠倒混匀后直接在37℃恒温水浴锅处理25min。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(3)的具体步骤为：取1μL RPA扩增产物与49μL的LFD检测缓冲液混合，将LFD置入上述混合液中，5min内观察结果，若同时出现检测条带和对照条带，则该样品多杀性巴氏杆菌核酸阳性，仅出现对照条带则说明该样品中不含多杀性巴氏杆菌，如果仅出现检测条带或者无条带则说明RPA-LFD检测不成立。