[发明专利]家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体及其制备方法，制备方法包括以下步骤：第一步、GAPDH/pET‑28a原核表达载体构建：（1）家蚕RNA提取；（2）反转录；（3）PCR扩增；（4）GAPDH/pMD‑19T构建；（5）GAPDH/pET‑28a重组质粒构建；第二步、GAPDH融合蛋白的原核表达；第三步、GAPDH多克隆抗体的制备；制备的GAPDH多克隆抗体特异性高、成本低、周期短，不仅为进一步获得可商品化的GAPDH抗体奠定基础，为家蚕及其他近源昆虫蛋白的功能研究提供有力工具和技术支撑，同时也弥补市场上商品化内参抗体大多来源于哺乳动物的缺陷，增加内参抗体的多样性和选择性。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体及其制备方法。

背景技术

近年来，随着生物信息学的发展，不同物种基因组测序的完成和大量转录组数据的积累，越来越多新的基因被鉴定出来，基因和蛋白表达水平的研究在后基因组学的众多研究领域中尤为突出，为了更为准确的了解基因表达调控及其编码蛋白的功能，在转录和翻译水平上对目的基因和蛋白的分析极为重要。目前对基因进行表达定量的常用方法有实时定量 PCR、RNA印迹、核糖核酸酶保护分析、基因芯片等，在蛋白水平进行定量的方法有蛋白印迹、免疫共沉淀等，都需应用内参基因对目的基因和蛋白进行校正，以获得真实可靠的结果。

内参即内部参照，一般是由管家基因编码表达的蛋白，管家基因有几百种，最常用的有甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）、肌动蛋白（Actin3）、微管蛋白（Tubulin）、组蛋白（H3）、核糖体蛋白L3（RPL3）和泛素结合蛋白（UBC）等。不同的内参基因具有不同的生物学功能，参与不同的生物调节。GAPDH 是一种重要的糖酵解酶，它催化三磷酸甘油酸氧化磷酸化成为1，3-二磷酸甘油酸，主要有参与能量代谢、DNA 修复、蛋白表达调节等多种生理功能。另外哺乳动物 GAPDH 蛋白还具有各种生物性能，如运输和膜融合中的作用、微管组装、核输出和蛋白磷酸转移酶/激酶反应。同时也发现真核生物 GAPDH 与细胞附着有关，可能起到增强细胞骨架结构的作用。GAPDH 作为管家基因，在真核和原核生物中高度保守，氨基酸序列同源性高达70%-100%，且在同种组织或细胞的不同时期表达量相对恒定，因而被作为内参蛋白广泛应用。

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物，在研究昆虫遗传发育、基因调控分子机制和功能基因组学中具有重要作用。针对家蚕特殊的生命周期，其信号传导、蛋白合成与代谢的变化快速显著，其各组织的分化特异性高，组织之间的功能差异较大，选择合适的内参不仅可用于分析家蚕中基因和蛋白表达水平，也可以用于鳞翅目其他昆虫基因和蛋白的功能研究。目前市场上商品化的 GAPDH 内参抗体的抗原多为哺乳动物来源，具有蛋白特异性和种属通用性的蛋白序列，其检测种属较为广泛。虽然商品化的 GAPDH、Actin和Tubulin的抗体在大部分动物和分昆虫中都具有序列保守性，但其在家蚕中的杂交效果一直不佳，且商品化GAPHD内参抗体多为单克隆抗体，制备成本高，周期长，且为哺乳动物来源，虽与昆虫GAPDH蛋白序列具有一定同源性，但其在家蚕中的特异性不高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体的制备方法，具有特异性高、成本低、周期短的优势，不仅为进一步获得可商品化的GAPDH抗体奠定了基础，为家蚕及其他近源昆虫蛋白的功能研究提供有力的工具和技术支撑，同时也弥补了市场上商品化内参抗体大多来源于哺乳动物的缺陷，增加了内参抗体的多样性和选择性。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

第一步、GAPDH /pET-28a原核表达载体的构建：

（1）家蚕RNA提取；