[发明专利]家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体及其制备方法

权利要求书

1.一种家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步、GAPDH /pET- 28a原核表达载体的构建：

（1）家蚕RNA提取；

（2）反转录：以RNA为模板，反转录合cDNA；

（3）PCR扩增：设计一对引物：

上游引物GAPDH-BamH I：5＇-ATGGATCCATGTCAAAAATTGGAAT-3＇；

下游引物GAPDH-EcoR I：5＇-GCGAATTCTTAATCTTTAGATTGAAT-3＇；

以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR产物通过胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收；

（4）GAPDH/pMD-19T构建：将回收的目的片段与pMD-19T载体按照摩尔比3：1用SolutionI连接酶16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和双酶切鉴定，对两次鉴定后正确的质粒进行测序，获得GAPDH/pMD-19T；

（5）GAPDH/pET-28a重组质粒构建：测序正确的GAPDH/pMD-19T采用BamH I和EcoR I进行双酶切，切胶纯化回收目的片段，纯化的目的片段与pET-28a载体以摩尔比3：1用T4 DNA连接酶16℃连接30min，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性菌落，进行PCR和酶切鉴定，得到GAPDH/pET-28a重组质粒；

第二步、GAPDH融合蛋白的原核表达：

将重组质粒GAPDH/pET-28a转入大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，37℃，220r/min振荡培养过夜；次日，按照体积比1：100的比例接种到100ml新的含有卡那霉素培养基中，37℃，220r/min至OD600值为0.6-0.8时，按体积比1：1000的比例加入终浓度为0.4mmol/L IPTG，37℃，220r/min，3h，诱导目的蛋白表达，收集诱导后有目的蛋白表达的菌液，用pH7.4，50mmol/L Tris-HCl 缓冲液重悬，超声破碎后的样品4℃，12000r/min离心5min，得上清和沉淀，沉淀纯化后得纯化后的GAPDH融合蛋白；

第三步、GAPDH多克隆抗体的制备：

将纯化后的GAPDH融合蛋白作为抗原与等体积的弗氏完全佐剂进行1：1充分混合乳化，在新西兰纯种大白兔双肩周围皮下进行多点注射，注射前取少量正常血清作为阴性对照；

首次免疫10天后，以相同抗原与等体积的弗氏不完全佐剂1：1充分混合进行第2次免疫，之后每隔7-10天免疫1次，免疫3次后取少许血清检测免疫效果，经4次免疫 10 天后，进行心脏采血，分离血清，得到GAPDH多克隆抗体；

所述第一步（3）中PCR反应体系：10×buffer 2µl，dNTP 1.6 µl， cDNA 1µl，rTaq酶0.2µl，上下游引物各0.8µl，用无菌水补至20µl；PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，然后循环30次；72℃延伸10min。

2.一种利用权利要求1所述的制备方法制备的家蚕内参蛋白GAPDH多克隆抗体。