[发明专利]一种远场光学超分辨显微方法

说明书

本发明公开了一种远场光学超分辨显微方法，具体涉及对样品表面微小结构的光学超分辨显微方法。本发明通过激光干涉测振仪测量不同微小样品的振动模态，利用样品表面微小结构的本征振动频率差异，再配合亚纳米二维位移扫描平移台，绘制出高分辨的空间位置、激励频率的振动谱和像图，从而实现超分辨显微成像。由于该发明是利用样品表面的微小结构的振动频率差异来标识，而且微小结构的振动是采用激光激励和激光检测，因此该方法具有对样品无标记、无损伤、无污染的特征。

技术领域

本发明涉及远场超分辨率显微以及材料性能表性技术领域，具体涉及一种远场光学超分辨显微方法。

背景技术

光学显微镜的发明，为人类叩开了神秘的微观世界的大门，人类从此开始走进另一个全新的微观世界，人们对微小样品的分辨能力也从头发丝粗细的亚毫米级跨度到了诸如细菌、细胞器等尺度的亚微米级。然而，受光学衍射极限的制约，光学显微镜的分辨极限也就停滞在亚微米水平，为了实现对更精细结构的了解，人们试图采取各种各样的办法绕过衍射极限的制约，例如近场扫描光学显微镜(Near-field Scanning OpticalMicroscope,NSOM)的问世。

由于近场光学显微镜收集的是携带了高频信息的倏逝波(Evanescent Wave)，其电场强度随传播距离的增加呈指数衰减，如果使用距样本表面几个纳米的探针收集并探测近场光信号，可以大幅提高光学显微镜的分辨率，其分辨率优于25nm。

另外一类提高分辨率的方法是基于远场光学显微镜的超分辨成像技术，主要包括两种实现途径：一种是基于特殊强度分布照明光场的超分辨成像方法(如STED)。另一种是基于单分子成像和定位的方法(如PALM)。

受激发射损耗显微镜技术(Stimulated Emission Depletion Microscopy，简称STED)来源于爱因斯坦的受激辐射理论。1994年德国科学家Stefan W.Hell等人提出了STED显微镜理论并创造性地利用受激辐射来抑制自发荧光辐射，最终实现了受激发射损耗显微镜技术，其分辨率可达35nm。一个典型的STED显微镜需要两束严格共轴的激光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光。利用激发光使艾里斑范围内的荧光分子被激发，其电子从基态跃迁到激发态。随后，使用甜甜圈型的损耗光照射样品，使得处于激发光斑外围的激发态分子以受激辐射的方式释放能量回到基态，而位于激发光斑内部区域的激发态分子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。这种照明方式的组合，将荧光发射区域限制在小于艾里斑的区域内，获得了一个小于衍射极限的荧光发光点。最后，通过在二维(或三维)空间内扫描共轴的激发光和损耗光，获得一幅二维(或三维)超分辨图像。

光活化定位显微镜技术(Photoactivation Localization Microscopy，简称PALM)是另外一种基于远场成像的超分辨技术。阿贝极限指出，在远场无法分辨相距λ/2NA(Numerical Aperture)的两个荧光蛋白分子所成的像，但是并没有对单个荧光分子的中心位置确定精度进行限制。如果在艾里斑内仅有一个蛋白分子在发射荧光,我们可以利用单分子定位算法并结合光学系统艾里斑的形状，以超高精度(纳米量级)获得荧光蛋白分子的中心位置。将这个单分子定位思想用于实现超分辨成像，其关键在于如何在一个艾里斑内区分多个荧光蛋白分子。为了克服一个艾里斑内只允许一个蛋白分子发射荧光的限制,1995年美国科学家Eric Betzig通过理论分析，提出可以利用光谱特性对艾里斑内的发射波长不同的荧光蛋白分子进行分时探测和中心位置定位，从而实现荧光密集标记样本的超分辨成像。2006年，Eric Betzig等人利用光活化荧光蛋白(PA-FP)的可控荧光开关特性，结合单分子定位算法，实现了生物样本的超分辨成像。他们利用低能量的405nm脉冲激光(活化光)活化PA-FP，用561nm连续激光(激发光)对活化后的PA-FP进行单分子荧光成像，直至活化后的PA-FP分子被光漂白。重复活化-测量-漂白过程，可以在艾里斑内高精度找到大量PA-FP分子的中心位置，从而重建出一幅由PA-FP分子中心位置组成的超分辨图像。