[发明专利]一种肺癌EGFRT790M位点的ddPCR检测优化方法及应用

权利要求书

1.一种肺癌EGFR T790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)对cfDNA提取进行优化，提高cfDNA纯度，降低cfDNA投入量；

2)采用针对肺癌相关的EGFR T790M位点设计引物对cfDNA进行扩增；

3)采用针对肺癌相关的EGFR T790M位点设计的探针对cfDNA扩增产物进行检测，对探针荧光信号值进行数据分析，获得准确的EGFR T790M位点信息。

2.根据权利要求1所述的肺癌EGFR T790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，步骤1)中，对cfDNA提取进行优化包括，在抽取之后4h内进行分离，外周血在抽提过程中不加入carrier RNA，抽提过程中采用两步醇沉纯化法，提高cfDNA提取纯度。

3.根据权利要求2所述的肺癌EGFR T790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，步骤1)中，外周血的分离条件为：外周血第一次离心(1600g，10min)后分离为血细胞和血浆(上清液)，血细胞储存在-80℃保存；血浆样本进行第二次离心(16000g，10min)，取上清液转移至保存管中，置于-80℃保存。

4.根据权利要求2所述的肺癌EGFR T790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，步骤1)中，两步醇沉纯化法为：第一次异丙醇沉淀cfDNA、洗去杂质，第二次无水乙醇沉淀、洗去杂质之后洗脱即为所需的cfDNA样本。

5.根据权利要求1所述的肺癌EGFR T790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，步骤2)中，PCR扩增过程中采用针对EGFR T790M位点设计的特异性引物对，并且引物对的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，或引物对的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，或引物对的序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。

6.根据权利要求1所述的肺癌EGFR T790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，步骤3)中，检测过程中根据EGFR T790M野生型和突变型位点设计的特异性荧光探针；其中突变型检测探针序列如SEQ ID NO:3，或SEQ ID NO:7，或SEQ ID NO:11所示；野生型检测探针序列如SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:8，或SEQ ID NO:12所示。

7.根据权利要求6所述的肺癌EGFR T790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，步骤3)中，检测探针的3’端均具有MGB-NFQ修饰，野生型检测探针5’端具有HEX荧光基团修饰，突变型检测探针5’端具有FAM荧光基团修饰。

8.根据权利要求1所述的肺癌EGFRT790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，步骤2)-步骤3)中，PCR扩增、检测体系采用的引物/探针比例是经过优化调整的。

9.根据权利要求1所述的肺癌EGFRT790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，步骤2)-步骤3)中，PCR扩增、检测的退火温度是根据探针和引物的GC含量确定、优化的。

10.根据权利要求1所述的肺癌EGFR T790M位点的ddPCR检测优化方法，其特征在于，步骤3)中，数据分析包括荧光阈值确定，检测阈值确定，以及阴、阳性结果判读；荧光阈值的确定包括空白对照组和阴性对照组荧光阈值的确定；检测阈值的确定包括最低检测限的阳性对照组阈值的确定；阴、阳性结果的判读包括依据阴性对照组、最低检测限的阳性对照组以及强阳性对照组的数据分析对检测结果进行分析、判定。

11.权利要求1-10任一项所述的肺癌EGFRT790M位点的检测优化方法在肺癌检测试剂盒或肺癌检测设备中的应用。

12.一种肺癌EGFR T790M位点ddPCR检测优化的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有突变型和野生型荧光检测探针和对目标区域PCR特异性扩增的引物对，并且，所述试剂盒采用权利要求1-10任一项所述的肺癌EGFR T790M位点的检测优化方法对待测样品进行检测。