[发明专利]荧光定量RT‑PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对、探针、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对、探针、试剂盒及方法。

背景技术

大鼠疑似泰勒氏病毒(Rat Theiler's-like virus,TLV)，TLV属于小RNA病毒科心病毒属成员，代表株为NGS910，基因组大小为8.021kb。其L基因的开放性阅读框(ORF)与泰勒氏鼠脑脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus,TMEV)有72％同源，与脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)同源性为55％～56％。TLV主要侵害大鼠中枢神经系统，多数呈隐性感染，有时表现脑脊髓炎、脑膜炎和后肢麻痹等症状。一旦污染了TLV，将会对实验大鼠及其生物技术产品造成巨大的经济损失。

巴西JC Jo等1995-2012年收集的样品中TLV抗体阳性率为9％，为第二常见病毒。2000-2003年的检测数据显示：TLV阳性率在2.3％，仅次于细小病毒。王翠娥等(2014)利用血清学检测和免疫荧光试验(IFA)发现：国标SPF登记要求检测范围以外的TLV、K病毒、大鼠呼吸道病毒(RRV)等出现阳性。有此可见，TLV是非常重要的待检病原。在国内该病的研究亦几乎处于空白。

目前，国际上常用的TLV检测方法是血清学检测，其中大鼠的采血，血清分离都是特别繁琐和耗时，且现如今市场上有的大鼠疑似泰勒氏病毒感染检测ELISA试剂盒，大部分为进口试剂盒，价格都在2000-3000元左右，而且仅可以检测96乘以2个样。因此，传统的方法存在着繁琐、局限性、灵敏度低、价格高等不足，急需开发一种简便、快速、准确检测TLV的方法和试剂盒产品。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对、探针、试剂盒及方法，该试剂盒及方法能快速、准确、灵敏、特异地对TLV病毒进行检测。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的引物对，所述引物对具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的碱基序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的探针，所述探针具有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。

优选的，所述探针的5’结合有FAM，所述探针的3’结合有BHQ1。

在本发明的另一方面，还提供了一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物对、以及SEQ ID No:3所示的探针。

优选的，所述试剂盒还包括：含有大鼠疑似泰勒氏病毒TLV NGS910毒株SEQ ID No:4所示部分基因序列的阳性重组质粒标准品。

在本发明的另一方面，还提供了一种荧光定量RT-PCR检测大鼠疑似泰勒氏病毒的方法，包括以下步骤：以大鼠脑组织的cDNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物，SEQ ID No:3为探针，进行荧光定量PCR扩增，采集荧光信号。

在其中一些实施例中，所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：Premix Ex Taq 10μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、cDNA模板2μL、SEQ ID No:1引物0.4μL、SEQ ID No:2引物0.4μL、SEQ ID No:3探针0.8μL、加灭菌蒸馏水至20μL。

在其中一些实施例中，所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃预变性30sec；95℃变性5sec，60℃退火延伸34sec，40个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明通过设计出特异性的引物对和探针，优化荧光定量RT-PCR检测方法的反应条件，从而快速、准确、特异性地针对大鼠疑似泰勒氏病毒(TLV)进行检测，不仅可以实现对实验大鼠的大样本筛查，也可以对细胞系和生物原材料进行外源因子检测；

2、本发明的荧光定量RT-PCR检测方法只需收集能提取到微量的cDNA的组织即可，且仅需要合成引物对，探针，便可方便快捷的检测几千个样本，便捷廉价；