[发明专利]一种重组CHOK1细胞株的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药和生物技术领域，尤其是涉及一种能稳定表达截短型EBNA1蛋白的重组CHOK1细胞株的构建方法及其在重组蛋白瞬时表达中的应用。

背景技术

随着生物技术药物的发展，能够快速生产毫克到克级别的重组蛋白瞬时表达体系被广泛用于新药筛选和临床前研究。CHO细胞是目前重组蛋白瞬时表达体系中最常用的宿主细胞系之一。CHO细胞的大规模瞬转技术，目前主要是根据Florian M.Wurm等人的方案，转染前一天进行细胞传代，然后转染当天离心更换新鲜培养基并使细胞达到一个较高的密度(2×10⁶cells/ml)，然后用PEI(聚乙烯亚胺)作为转染试剂进行转染，转染后降温培养以抑制细胞增殖，从而维持细胞活率。

其中，PEI是一种化学转染试剂，相较于科研机构常用的阳离子脂质体转染试剂，成本较低，更适用于工业生产，在规模较大的重组蛋白瞬时表达生产中更能提高其性价比高的特点。其中25kDa线性结构的PEI因为其适用性广，转染效率普遍不错，所以相比于其他分子量(如40kDa)和其他结构(如树枝状)的PEI，很多文献都报道更亲睐于使用25kDa线性结构的PEI作为转染试剂。

EB病毒(Epstein–Barr virus)也称人疱疹病毒4，主要感染人的上皮细胞和免疫系统的B细胞。在EB病毒感染的整个潜伏感染期只有EBNA1(Epstein–Barr nuclear antigen 1，EB病毒核抗原)始终有表达。EBNA1上有DNA连接区、转录激活结构域、甘氨酸-丙氨酸重复区、核定位信号序列、DNA结合和二聚化区。EBNA1能与病毒质粒上的OriP(病毒复制起点)结合，在核定位信号引导和宿主细胞胞浆转录因子的协助下，携带病毒质粒进入细胞核，并通过DNA连接区结合在染色体相应位点，使病毒质粒能够随着染色体复制而复制。与此同时，EBNA1上的转录激活结构域使其发挥反式作用蛋白的作用，其作用位点也是OriP，发挥其顺式作用元件的作用，促进下游基因的转录。而甘氨酸-丙氨酸重复区的作用是稳定EBNA1成熟蛋白质的构象和避免其被蛋白酶降解。

因此，可否利用EB病毒的EBNA1表达及其与病毒质粒上的OriP结合的特点，构建一种重组CHOK1细胞株，并设计相应的瞬时表达载体、细胞转染和培养工艺，使其能够在重组蛋白瞬时表达的实际生产中仍能获得较高的表达量，而且工艺简便成本低廉，适用于大规模生产或者小体积高通量筛选，是本领域有待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种重组CHOK1细胞株的构建方法，该重组CHOK1细胞株能够稳定表达截短型EBNA1蛋白(简称EBNA1t)，在重组蛋白瞬时表达的实际生产中能够使用PEI作为转染试剂，表达量高而且工艺简便成本低廉，适用于大规模生产或者小体积高通量筛选。

本发明所要解决的技术问题之二在于，提供适合于该重组CHOK1细胞株在重组蛋白瞬时表达中的瞬时表达载体、细胞转染和培养工艺，在表达量高的同时工艺简便成本低廉。

为解决上述技术问题之一，本发明提供一种重组CHOK1细胞株的构建方法，能够稳定表达截短型EBNA1蛋白(简称EBNA1t)，包括以下步骤：

(1)EBNA1t表达载体的构建。

如图1所示，EBNA1蛋白全长共641个氨基酸，包括以下功能结构域：(1)DNA连接区1：33-89aa；(2)转录激活区：65-89aa；(3)甘氨酸-丙氨酸重复区：90-327aa；(4)DNA连接区2，328-378aa；(5)细胞核定位信号，379-386aa；(6)DNA结合及二聚化区，459-604aa。

去除EBNA1蛋白的甘氨酸-丙氨酸重复区后，得到截短型的EBNA1蛋白(EBNA1t)。经检测截短型的EBNA1蛋白(EBNA1t)功能不受影响。

EBNA1t cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其能够在CHOK1细胞中高效的表达EBNA1t蛋白，且EBNA1t功能不受影响。