[发明专利]一种重组CHOK1细胞株的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种能够稳定表达截短型EBNA1蛋白的重组CHOK1细胞株的构建方法，包括以下步骤：

(1)EBNA1t表达载体的构建

定义截短型EBNA1蛋白为EBNA1t；将如SEQ ID NO:1所示序列克隆至pWX1.0和pWX2.0载体中，得到pWX1.0-Z-EBNA1t和pWX2.0-B-EBNA1t；

(2)转染与细胞群筛选

使用阳离子脂质体将pWX1.0-Z-EBNA1t和pWX2.0-B-EBNA1t共转染CHOK1宿主细胞；

转染后48小时，将细胞接种到96孔板中培养，使用含有抗生素Blasticidin和Zeocin的CD CHO培养基筛选；

筛选2-3周后，将96孔板中存活下来的细胞分别扩增，得到若干细胞群；

将目标单克隆抗体的瞬时表达载体，使用PEI转染至各细胞群中，10天后收获细胞培养上清，评估目标单克隆抗体的表达量，挑选出目标单克隆抗体表达量最高的细胞群用于后续有限稀释法克隆；

(3)有限稀释法克隆

通过有限稀释法从细胞群中分离到单克隆；挑选出目标单克隆抗体表达量最高的CHOK1-EBNA1t单克隆细胞株。

2.如权利要求1所示的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，SEQ ID NO:1所示序列为优化后的EBNA1t cDNA序列，是通过去除EBNA1蛋白的甘氨酸-丙氨酸重复区：90-327aa后，得到截短型的EBNA1蛋白。

3.如权利要求1所示的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，pWX1.0和pWX2.0载体分别含有Zeocin和Blasticidin的抗性基因。

4.如权利要求1所示的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，培养容器为125ml-5l摇瓶，条件为36.5℃、85％湿度、6％CO₂、150RPM。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，使用含有抗生素Blasticidin和Zeocin的CD CHO培养基培养CHOK1-EBNA1t单克隆细胞株；将目标单克隆抗体的瞬时表达载体，使用PEI转染至各单克隆细胞株中，10天后收获细胞培养上清，评估目标单克隆抗体的表达量。

6.一种截短型EBNA1蛋白cDNA序列，其特征在于，如SEQ ID NO:1所示。

7.一种截短型EBNA1蛋白的表达载体pWX1.0-Z-EBNA1t，其特征在于，是通过将如SEQ ID NO:1所示序列克隆至pWX1.0载体中得到，所述pWX1.0含有Zeocin的抗性基因。

8.一种截短型EBNA1蛋白的表达载体pWX2.0-B-EBNA1t，其特征在于，是通过将如SEQ ID NO:1所示序列克隆至pWX2.0载体中得到，所述pWX2.0含有Blasticidin的抗性基因。

9.一种重组CHOK1-EBNA1t细胞株用于重组蛋白瞬时表达的应用，其特征在于，所述CHOK1-EBNA1t细胞株是通过如权利要求1-5任一项所述方法获得，所述应用包括以下步骤：

(1)构建重组蛋白瞬时表达载体

将重组蛋白序列分别克隆到含有OriP序列的表达载体pWX4.0-OriP中，得到用于瞬时转染的重组蛋白瞬时表达载体；所述OriP序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)转染前进行细胞传代培养

转染前，将CHOK1-EBNA1t细胞株稀释传代至新鲜的CD CHO培养基，进行传代培养；

(3)转染与细胞培养工艺

使用25kDa线性PEI将步骤(1)得到的重组蛋白瞬时表达载体转染步骤(2)传代培养获得的CHOK1-EBNA1t细胞株；表达载体与PEI的用量比例为1:2-1:7，每毫升细胞悬液中含表达载体1-4μg；

(4)收获细胞上清，评估重组蛋白的表达量。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，转染前1天，将细胞按照6-1010⁵cells/ml传代新鲜CD CHO培养基；培养温度为36.5℃。

11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，转染后的培养温度为29-34℃。