[发明专利]激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法

说明书

本发明公开了一种激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法，其特征在于：覆盖人类基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1上的总共1357种体细胞突变。本发明的构建方法针对多个靶序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要45分钟即可，可以十分有效的解决目前对于临床上乳腺癌复发监测中在少量的外周血样本基础上需要对体细胞多基因、多靶点检测这一难点，且成本低廉。

技术领域

本发明涉及一种用于高通量测序检测的激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法。

背景技术

乳腺癌未来将成为癌症幸存者最多的群体，其依据早期分子分型存在着两个复发高峰期，分别为术后1-3年和5-10年，期间需进行反复的影像学等检查，尤其是激素受体阳性患者，内分泌治疗已被建议延续至10年，但尚无疗效预测因子能精准鉴别获益人群，且具有诸多并发症，因此研发乳腺癌无创疗效预测与监测系统是十分必要的，将降低患者放射学受量和减少患者接受不必要的治疗副作用。CA15-3、CEA等传统肿瘤标志物在监测乳腺癌复发方面敏感性与特异性均较差，循环肿瘤细胞(CTC)检测新近也被认为价值有限。循环肿瘤DNA(ctDNA)则极具应用前景，有证据表明其在乳腺癌患者中的检测敏感性与准确评估肿瘤负荷变化等方面均显著强于前两者。肿瘤高通量测序等技术发展，在提高ctDNA检测灵敏度(5-10ng，约10ml血液/例)的同时，也在不断降低其检测成本。

另一方面，激素受体阳性乳腺癌约占总发病率的75％，内分泌治疗是该类型晚期乳腺癌优先推荐的治疗手段。然而，这种治疗决策仅根据初始治疗所确定的分子分型以及当前临床表现是否为“惰性”的主观判断，而乳腺癌原发病变与转移灶的分子生物学特征已被证实具有显著差异；同时，一旦应用内分泌治疗，其起效时间平均需2个月左右，期间又常受到“闪烁”现象干扰，导致常规检测手段失真；另外，该类型晚期乳腺癌常多发皮肤与骨转移，上述病灶很难应用现有影像学手段予以客观评价。这些因素常给该型患者的治疗决策造成巨大困扰，限制内分泌治疗的最大受益。临床前研究证实，血清ESR1等ct DNA突变定量检测能预测内分泌治疗疗效与准确评估肿瘤负荷的动态变化。

乳腺癌复发与转移后突出表现的瘤间与瘤内异质性，以及其随治疗进程呈现的时空异质性演变，是当前临床诊治面临的最大挑战。在晚期乳腺癌患者中应用肿瘤组织DNA与循环肿瘤DNA联合进行基因突变分析，经证实有较高的一致性(可达76％)，表明ctDNA具有替代晚期乳腺癌患者组织活检的可行性，这也有助于破解晚期乳腺癌患者难以反复活检的临床难题。同时，乳腺癌基因组学研究的进展，初步确定了与内分泌治疗、化疗、靶向治疗敏感性或抗拒性有关的突变基因，因此可通过ctDNA检测解析其动态变化及其意义。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种用于高通量测序检测的激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

覆盖人类基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1上的总共1357种体细胞突变，具体包括如下步骤：

(1)针对目的基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；