[发明专利]激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法

权利要求书

1.激素受体阳性乳腺癌复发监测基因突变文库的构建方法，其特征在于，覆盖人类基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1上的总共1357种体细胞突变，具体包括如下步骤：

（1）针对目的基因KRAS、JAK3、AKT1、CREBBP、PTEN、RB1、TP53、CTNNB1、TSC2、TSC1、ERBB2、PIK3CA、SF3B1、JAK2、CDH1、SMAD4、GATA3、MAP2K4、MAP3K1和ESR1设计基本扩增引物组，该基本扩增引物组的正向引物和反向引物的5’端设有额外的2～5个T，且该2~5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；

（2）将模板、上述基本扩增引物组置于一含有RingCap-Taq酶的PCR反应体系中进行扩增，纯化后得扩增产物；将扩增产物、多对第一不对称连接探针、通用引物和上述RingCap-Taq酶混合进行PCR，纯化后获得文库产物；

上述RingCap-Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成；

基本扩增引物组包括ZQ-KRAS-1-F、ZQ-KRAS-1-R、ZQ-KRAS-2-F、ZQ-KRAS-2-R、ZQ-KRAS-3-F、ZQ-KRAS-3-R、ZQ-JAK3-1-F、ZQ-JAK3-1-R、ZQ-JAK3-2-F、ZQ-JAK3-2-R、ZQ-JAK3-3-F、ZQ-JAK3-3-R、ZQ-AKT1-1-F、ZQ-AKT1-1-R、ZQ-CREBBP-1-F、ZQ-CREBBP-1-R、ZQ-PTEN-1-F、ZQ-PTEN-1-R、ZQ-PTEN-2-F、ZQ-PTEN-2-R、ZQ-PTEN-3-F、ZQ-PTEN-3-R、ZQ-PTEN-4-F、ZQ-PTEN-4-R、ZQ-PTEN-5-F、ZQ-PTEN-5-R、ZQ-PTEN-6-F、ZQ-PTEN-6-R、ZQ-PTEN-7-F、ZQ-PTEN-7-R、ZQ-RB1-1-F、ZQ-RB1-1-R、ZQ-TP53-1-F、ZQ-TP53-1-R、ZQ-TP53-2-F、ZQ-TP53-2-R、ZQ-TP53-3-F、ZQ-TP53-3-R、ZQ-TP53-4-F、ZQ-TP53-4-R、ZQ-TP53-5-F、ZQ-TP53-5-R、ZQ-TP53-6-F、ZQ-TP53-6-R、ZQ-TP53-7-F、ZQ-TP53-7-R、ZQ-TP53-8-F、ZQ-TP53-8-R、ZQ-CTNNB1-1-F、ZQ-CTNNB1-1-R、ZQ-TSC2-1-F、ZQ-TSC2-1-R、ZQ-TSC1-1-F、ZQ-TSC1-1-R、ZQ-TSC1-2-F、ZQ-TSC1-2-R、ZQ-ERBB2-1-F、ZQ-ERBB2-1-R、ZQ-ERBB2-2-F、ZQ-ERBB2-2-R、ZQ-ERBB2-3-F、ZQ-ERBB2-3-R、ZQ-ERBB2-4-F、ZQ-ERBB2-4-R、ZQ-ERBB2-5-F、ZQ-ERBB2-5-R、ZQ-ERBB2-6-F、ZQ-ERBB2-6-R、ZQ-ERBB2-7-F、ZQ-ERBB2-7-R、ZQ-PIK3CA-1-F、ZQ-PIK3CA-1-R、ZQ-PIK3CA-2-F、ZQ-PIK3CA-2-R、ZQ-PIK3CA-3-F、ZQ-PIK3CA-3-R、ZQ-SF3B1-1-F、ZQ-SF3B1-1-R、ZQ-SF3B1-2-F、ZQ-SF3B1-2-R、ZQ-JAK2-1-F、ZQ-JAK2-1-R、ZQ-CDH1-1-F、ZQ-CDH1-1-R、ZQ-CDH1-2-F、ZQ-CDH1-2-R、ZQ-CDH1-3-F、ZQ-CDH1-3-R、ZQ-CDH1-4-F、ZQ-SMAD4-1-F、ZQ-SMAD4-1-R、ZQ-GATA3-1-F、ZQ-GATA3-1-R、ZQ-MAP2K4-1-F、ZQ-MAP2K4-1-R、ZQ-MAP2K4-2-F、ZQ-MAP2K4-2-R、ZQ-MAP3K1-1-F、ZQ-MAP3K1-1-R、ZQ-MAP3K1-2-F、ZQ-MAP3K1-2-R、ZQ-MAP3K1-3-F、ZQ-MAP3K1-3-R、ZQ-MAP3K1-4-F、ZQ-MAP3K1-4-R、ZQ-ESR1-1-F、ZQ-ESR1-1-R、ZQ-ESR1-2-F和ZQ-ESR1-2-R；

KRAS基因引物名称：ZQ-KRAS-1-F，序列信息TTTTCATGTACTGGTCCCTCATTG；ZQ-KRAS-1-R，序列信息TTTTGTAATAATCCAGACTGTGTTTCTCC；ZQ-KRAS-2-F，序列信息TTTTGTTATGATTTTGCAGAAAACAGAT；ZQ-KRAS-2-R，序列信息TTTTGCCTTCTAGAACAGTAGACACAAAA；ZQ-KRAS-3-F，序列信息TTTTTACCTCTATTGTTGGATCATATTCGT；ZQ-KRAS-3-R，序列信息TTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTG；

JAK3基因引物名称：ZQ-JAK3-1-F，序列信息TTTTCCCAGACTGGATGTCAGTCT；ZQ-JAK3-1-R，序列信息TTTTCCACGGTCTGGGAAGTGTT；ZQ-JAK3-2-F，序列信息TTTTGAGATGCCGGTACGACACTT；ZQ-JAK3-2-R，序列信息TTTTGCAGGTCTGTGAGCACAAAATTT；ZQ-JAK3-3-F，序列信息TTTTCAAAGAGGTGCTCCAGGACTG；ZQ-JAK3-3-R，序列信息TTTTCTTTCATCCCAGGGTTCTCTCC；

AKT1基因引物名称：ZQ-AKT1-1-F，序列信息TTTTCCGCTCCTTGTAGCCAATGA；ZQ-AKT1-1-R，序列信息TTTTGGGTCTGACGGGTAGAGTGT；

CREBBP基因引物名称：ZQ-CREBBP-1-F，序列信息TTTTAATGTGCAGTCCAGGAAACAGAA；ZQ-CREBBP-1-R，序列信息TTTTACAGTCTCATCATACCACTATTATTT；

PTEN基因引物名称：ZQ-PTEN-1-F，序列信息TTTTGTTTTTGACAGTTTGACAGTTAAAG；ZQ-PTEN-1-R，序列信息TTTTTTCCCGTCGTGTGGGTCCT；ZQ-PTEN-2-F，序列信息TTTTTCAAATGTTAGCTCATTTTTGTTAATGG；ZQ-PTEN-2-R，序列信息TTTTTGCAAGCATACAAATAAGAAAACATACTT；ZQ-PTEN-3-F，序列信息TTTTACAGCTAGAACTTATCAAACCCTTTTGT；ZQ-PTEN-3-R，序列信息TTTTCCCGATGTAATAAATATGCACATATCATT；ZQ-PTEN-4-F，序列信息TTTTTAGAGCGTGCAGATAATGACAAGG；ZQ-PTEN-4-R，序列信息TTTTCCCACAAAATGTTTAATTTAACTGACC；ZQ-PTEN-5-F，序列信息TTTTTCTGTCCACCAGGGAGTA；ZQ-PTEN-5-R，序列信息TTTTACATTGGAATAGTTTCAAACATCATCTT；ZQ-PTEN-6-F，序列信息TTTTGACGGGAAGACAAGTTCATGTACT；ZQ-PTEN-6-R，序列信息TTTTTTCTCCCAATGAAAGTAAAGTACAAACCTT；ZQ-PTEN-7-F，序列信息TTTTTTAGGACAAAATGTTTCACTTTTGGG；ZQ-PTEN-7-R，序列信息TTTTACGCTCTATACTGCAAATGCTATCG；

RB1基因引物名称：ZQ-RB1-1-F，序列信息TTTTTCTGTGTGCTGAGAGATGTAATGAC；ZQ-RB1-1-R，序列信息TTTTTGATCCAAAAATAATCTTGCATCTAGATC；

TP53基因引物名称：ZQ-TP53-1-F，序列信息TTTTTCATAGGGCACCACCACACTAT；ZQ-TP53-1-R，序列信息TTTTGGCCTCTGATTCCTCACTGATTG；ZQ-TP53-2-F，序列信息TTTTCCATAGGTCTGAAAATGTTTCCTGACT；ZQ-TP53-2-R，序列信息TTTTGTTGGAAGTGTCTCATGCTGGAT；ZQ-TP53-3-F，序列信息TTTTGTAGCTGCCCTGGTAGGTTT；ZQ-TP53-3-R，序列信息TTTTGAAGCTCCCAGAATGCCAGA；ZQ-TP53-4-F，序列信息TTTTTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTG；ZQ-TP53-4-R，序列信息TTTTTACTGGGACGGAACAGCTTTG；ZQ-TP53-5-F，序列信息TTTTCAGCTGCTCACCATCGCTAT；ZQ-TP53-5-R，序列信息TTTTAGCTGTGGGTTGATTCCACA；ZQ-TP53-6-F，序列信息TTTTCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTTTC；ZQ-TP53-6-R，序列信息TTTTCCGCAGAAATGGATACAGGTCAA；ZQ-TP53-7-F，序列信息TTTTGCCTGGGCATCCTTGAGTTC；ZQ-TP53-7-R，序列信息TTTTCTTGAACCATCTTTTAACTCAGGTAC；ZQ-TP53-8-F，序列信息TTTTCCTGACCTGGAGTCTTCCAGT；ZQ-TP53-8-R，序列信息TTTTTCTTGGGCCTGTGTTATCTCCTA；

CTNNB1基因引物名称：ZQ-CTNNB1-1-F，序列信息TTTTATGGCCATGGAACCAGACAGAA；ZQ-CTNNB1-1-R，序列信息TTTTTCCACATCCTCTTCCTCAGGATT；

TSC2基因引物名称：ZQ-TSC2-1-F，序列信息TTTTGGTGGTTTGTGACTTGCAGTTAAG；ZQ-TSC2-1-R，序列信息TTTTGCGACTTCACAAATCTGCCCTAT；

TSC1基因引物名称：ZQ-TSC1-1-F，序列信息TTTTACCACCTCTGCTTCCACTACT；ZQ-TSC1-1-R，序列信息TTTCTTACAGGCTTGACTGTTGTAATG；ZQ-TSC1-2-F，序列信息TTTTTGGCATAATTAGGCTTCTCAAAGTG；ZQ-TSC1-2-R，序列信息TTTTCGGATGACTACGTGCACATTTC；

ERBB2基因引物名称：ZQ-ERBB2-1-F，序列信息TTTTCTCCCATACCCTCTCAGCGTA；ZQ-ERBB2-1-R，序列信息TTTTAGCCATAGGGCATAAGCTGTG；ZQ-ERBB2-2-F，序列信息TTTTCAGAAGGTCTACATGGGTGCTT；ZQ-ERBB2-2-R，序列信息TTTTGCCAGCCCGAAGTCTGTAATTTT；ZQ-ERBB2-3-F，序列信息TTTTGGGCATCTGGATCCCTGATG；ZQ-ERBB2-3-R，序列信息TTTTTTCCTGTCCTCCTAGCAGGAG；ZQ-ERBB2-4-F，序列信息TTTTACGGTAATGCTGCTCATGGT；ZQ-ERBB2-4-R，序列信息TTTTTGCTGTCACCTCTTGGTTGTG；ZQ-ERBB2-5-F，序列信息TTTTCCCATCATGACTTTCTTTCTTGTCC；ZQ-ERBB2-5-R，序列信息TTTTCAGGTCACCATCAAATACATCGGA；ZQ-ERBB2-6-F，序列信息TTTTACAACACACAGTTGGAGGACTT；ZQ-ERBB2-6-R，序列信息TTTTCCCATCACACACCATAACTCCA；ZQ-ERBB2-7-F，序列信息TTTTGGGCATCTGGATCCCTGATG；ZQ-ERBB2-7-R，序列信息TTTTTTCCTGTCCTCCTAGCAGGAG；

PIK3CA基因引物名称：ZQ-PIK3CA-1-F，序列信息TTTTTACAGAGTAACAGACTAGCTAGAGACA；ZQ-PIK3CA-1-R，序列信息TTTTTAGCACTTACCTGTGACTCCATAGA；ZQ-PIK3CA-2-F，序列信息TTTTCAATCTTTTGATGACATTGCATACATTC；ZQ-PIK3CA-2-R，序列信息TTTTGGAAGATCCAATCCATTTTTGTTGTC；ZQ-PIK3CA-3-F，序列信息TTTTGATGCACAATAAAACAGTTAGCCAGA；ZQ-PIK3CA-3-R，序列信息TTTTGTTTGAGAATGTCAGTTAAGTTAATGAGC；

SF3B1基因引物名称：ZQ-SF3B1-1-F，序列信息TTTTTTCAACTAAACTTCTAAGATGTGGCAAG；ZQ-SF3B1-1-R，序列信息TTTTCTTCTTTATTGCCCTTCTTAAAAGCTGT；ZQ-SF3B1-2-F，序列信息TTTTACCCTTCCATAAAGGCTTTAACACA；ZQ-SF3B1-2-R，序列信息TTTTTGTTTGGTTTTGTAGGTCTTGTGGA；

JAK2基因引物名称：ZQ-JAK2-1-F，序列信息TTTTTTCCTTAGTCTTTCTTTGAAGCAGCA；ZQ-JAK2-1-R，序列信息TTTTAGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGAAA；

CDH1基因引物名称：ZQ-CDH1-1-F，序列信息TTTTATTTCTGCCCTGCAGTGAATTTTG；ZQ-CDH1-1-R，序列信息TTTTGATCTGTGGGTTATGAAACCGTAGA；ZQ-CDH1-2-F，序列信息TTTTCTAGTGTTCCTGGTCCTGACTTG；ZQ-CDH1-2-R，序列信息TTTTGTGATCACAGCTGTTGCTGTTG；ZQ-CDH1-3-F，序列信息TTTTGTGATCACAGTCACTGACACCAA；ZQ-CDH1-3-R，序列信息TTTTCCATGAGCAGTGGTGACACTTAG；ZQ-CDH1-4-F，序列信息TTTTAGAACGAGGCTAACGTCGTAATC；ZQ-CDH1-4-R，序列信息TTTTGTTGTTCACTGGATTTGTGGTGA；

SMAD4基因引物名称：ZQ-SMAD4-1-F，序列信息TTTTATGGATGTTCAGGTAGGAGAGACA；ZQ-SMAD4-1-R，序列信息TTTTCTTCTGTCCTGTGGACATTGGA；

GATA3基因引物名称：ZQ-GATA3-1-F，序列信息TTTTCCCAAGAACAGCTCGTTTAACC；ZQ-GATA3-1-R，序列信息TTTTGTCCAAAGGACAGGCTGGAT；

MAP2K4基因引物名称：ZQ-MAP2K4-1-F，序列信息TTTTTCTTCTGGACAGAAGTGGAAATATT；ZQ-MAP2K4-1-R，序列信息TTTTCAAGCAAGAAGGCCTGGACTTA；ZQ-MAP2K4-2-F，序列信息TTTTGTCTTTATGTTCCAGCCTGAAAGAATA；ZQ-MAP2K4-2-R，序列信息TTTTTCTTATTGTTACGCTACTGTGGCAA；

MAP3K1基因引物名称：ZQ-MAP3K1-1-F，序列信息TTTTCATTGGTATTGGTGGTGTTGATTATGT；ZQ-MAP3K1-1-R，序列信息TTTTGAGGATAAAATTCAGCAGGAAATTCCAAC；ZQ-MAP3K1-2-F，序列信息TTTTGTTTTAGCCAAGATCCAGGATTGATG；ZQ-MAP3K1-2-R，序列信息TTTTCCAGCTTTTAGTATTTCTCTGCCAACT；ZQ-MAP3K1-3-F，序列信息TTTTATGAGGTCTATGCACATGTGTTTCT；ZQ-MAP3K1-3-R，序列信息TTTTCACATCTCGTAAACCAGGAGACA；ZQ-MAP3K1-4-F，序列信息TTTTATTAGTATTGTACTGGGCTTTTATCTGT；ZQ-MAP3K1-4-R，序列信息TTTTTGCAGCTCCAAAATCTGCAATTC；

ESR1基因引物名称：ZQ-ESR1-1-F，序列信息TTTTGCTATGTTTTCATAGGAACCAGGGAAA；ZQ-ESR1-1-R，序列信息TTTTGCAAAATAATAGATTTGAGGCACACAAA；ZQ-ESR1-2-F，序列信息TTTTAAAGGCATGGAGCATCTGTACA；ZQ-ESR1-2-R，序列信息TTTTTTGGTCCGTCTCCTCCACGG。