[发明专利]弓形虫感染小鼠脑组织差异表达蛋白质、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质及其应用

说明书

本申请要求了2017年03月17日提交中国专利局的，申请号201710162190.0，发明名称为“弓形虫感染小鼠脑组织差异表达蛋白质、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及寄生虫学领域，涉及一种弓形虫感染小鼠脑组织差异表达蛋白质、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质及其应用；具体涉及一种应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法、还涉及一种与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、及其应用。

背景技术

弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种机会致病性原虫，可以引起世界性的人兽共患寄生虫病。据调查，约30％的世界人口有潜在的弓形虫感染，其中90％发生弓形虫脑炎的病人死亡，继发性瘫痪的比例更高。近年来，弓形虫慢性感染导致的中枢神经系统(central nervous system,CNS)损伤越发受到广泛关注，这类病患表现为局部或弥散性的神经损伤，常伴随精神症状和行为失常，如产生类似阿兹海默症的症状表现。

蛋白质组学技术已被广泛应用到包括寄生虫在内的许多生物体研究中，但目前寄生虫的基因图谱极不完善，因此给蛋白质组的研究带来了一定困难。

同位素标记相对和绝对定量(Isobaric Tags For Relative And Absolute Quantitation，iTRAQ)技术是美国应用生物系统公司2004年推出的一种体外同位素标记技术。作为一种新型蛋白质组学定量研究技术，iTRAQ技术可以在同一实验中对4种或8种不同样本进行蛋白质定量比较，对一个基因组表达的全部蛋白质或者一个复杂混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和分析鉴定。

目前还未有报道应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法。

此外，获得弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组之后，需要对差异表达蛋白质进行功能分析以及功能验证，才能挖掘出检测靶标、防治药物靶点；目前，由于有效获取弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法较为缺乏，导致关于弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质相互作用蛋白的研究也难以推进，不利于检测靶标、防治药物靶点的发现和应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法、与大脑发育调节蛋白相互作用的蛋白质或多肽、及其应用。

第一方面，本发明提供了一种应用iTRAQ技术研究弓形虫慢性感染小鼠脑组织差异表达蛋白质组的方法，包含以下步骤：

(1)小鼠脑蛋白的提取；

(2)对步骤(1)所得的蛋白质样品进行FASP酶解、肽段标记；

(3)对步骤(2)标记的蛋白质样品进行HPLC分离肽段混合物及LC-MS质谱分析；

(3)对上步所得的质谱鉴定结果进行生物信息学分析、定量分析，获取弓形虫慢性感染小鼠脑组织过程中的差异表达蛋白质。

优选地，步骤(1)中，小鼠包括昆明鼠、Balb/c鼠、沙鼠中的一种或多种。

优选地，步骤(1)中所述小鼠脑蛋白的提取，具体步骤为：分别取感染弓形虫的小鼠脑及健康SPF小鼠脑，进行RIPA裂解、超声、离心处理，收集上清液。

进一步优选地，所述超声处理的条件为：20W，工作0.8s，停0.8s，超声10次后放于冰上冷却，并重复6次。

进一步优选地，所述离心处理的条件为：4℃，12000rpm，离心20min，收集上清液。

优选地，步骤(2)中FASP酶切具体包括：

a)在对步骤(1)所得的蛋白质样品定量后，每个样本取200μg蛋白溶液置于离心管中，加入TCEP还原试剂，60℃反应1h；然后加入MMTS半胱氨酸封闭试剂，室温反应30分钟；获得还原烷基化后的蛋白溶液；

b)将还原烷基化后的蛋白溶液加入超滤管中，离心，弃掉收集管底部溶液；加入8M尿素(pH 8.5)，离心，弃掉收集管底部溶液；加入0.25M TEAB(pH 8.5)，离心，弃掉收集管底部溶液；更换新的收集管，在超滤管中加入0.5M TEAB，加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比优选为1:50)，37℃反应过夜；次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与蛋白质量比优选为1:100)，37℃反应4h，离心获得酶解消化后的肽段溶液。