[发明专利]一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR‑DGGE分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术工程领域，具体涉及一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法。

背景技术

虾仁的腐败不仅是虾仁本身的理化变化所致，更是腐败菌增殖的结果。不同的水产食品具有不同微生物生态类群，其独特的菌相构成取决于食品加工所使用的原料、加工参数和产品的贮藏条件等。在贮藏期内的微生物菌相往往不是固定的，这是因为在特定的贮藏环境中，微生物具有的忍耐力不同。前人对食品的微生物腐败进行了大量系统的研究，逐步认识到，虽然食品在加工流通过程中会受到多种细菌的侵染，但最终只有少部分细菌大量增殖，在腐败中占据主导地位，并且产生腐败代谢物(臭味、异味、颜色等)，这些菌被称之为特定腐败菌(Specific spoilage organisms SSO)。对于新鲜或者初加工的虾仁，SSO不仅数量少，而且所占总微生物的比例也非常小，但由于其对贮藏环境的忍耐力强，能够在特定的环境下快速增殖，并在贮藏期中产生代谢产物，到感官拒绝点时，SSO的数量得到了大量的积累，所占比例也大幅增加，与此同时代谢产物也有了迅速增加和积累，导致了虾仁的感官不可接受及其腐败变质的发生。不同的原料、加工工艺、包装、运输方式等会导致食品微生态系统的不同，所以特定腐败菌也会不同，因此必须针对不同产品进行微生物的菌相分析。

人们对食品贮藏过程中的细菌的研究，多采用传统的分离、纯化和鉴定方法，不仅繁杂耗时，而且受培养条件的影响，所用分离培养基不能满足所有细菌的营养需求，仅有很少一部分细菌能被分离到。因此传统培养方法不能全面反映食品贮藏过程中细菌的多样性与特定腐败菌的真实情况，结果准确性及可靠性差。

PCR-DGGE(PCR-denatured gradient gel electrophoresis)技术是基于微生物基因所包含的序列不同而对微生物的多态性进行分析，可对整个菌群多样性实现动态分析，并可同时检测多个样品，还可对不同样品进行比较，因而有利于研究不同来源样品中细菌菌群多样性的动态观察。

发明内容

为解决传统培养方法不能全面、准确反映虾仁低温贮藏过程中的细菌的种群结构、细菌多样性与特定腐败菌的问题，本发明提供了一种虾仁贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法。

本发明提供一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)、虾仁样品的预处理及菌体收集；

(2)、提取虾仁样品中微生物总DNA；

(3)、以提取的微生物总DNA为模板，进行细菌16S rRNA的PCR扩增，并检测；

(4)、将PCR产物进行DGGE电泳分析；电泳结束后染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱，在图谱上标记特异条带，切胶回收；

(5)、回收的DNA条带重新进行PCR扩增，然后测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性比对分析，确定细菌的归属，然后根据在DGGE图谱上标记的条带情况与鉴定出的细菌种类进行分析。

进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)、虾仁样品的预处理及菌体收集；

(2)、采用细菌微生物DNA提取液进行虾仁样品中微生物总DNA的快速提取；

(3)、以提取的微生物总DNA为模板，采用16S rRNA基因V3高变区F357-GC和R518区具有特异性的引物对，进行细菌16S rRNA的PCR扩增，将PCR反应的产物用琼脂糖凝胶电泳检测；

(4)、将PCR产物进行DGGE电泳分析；电泳结束后染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱，在图谱上标记特异条带，切胶回收；

(5)、回收的DNA条带重新进行PCR扩增，然后对产物进行测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性比对分析，确定细菌的归属，然后根据在DGGE图谱上标记的条带情况与鉴定出的细菌种类进行分析。

进一步地，所述虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为：样品为南美白对虾，从养殖塘捕捞后放入水泥池充气暂养一个晚上，捕捞打包并且冰藏后运到实验室的无菌室，无菌操作去壳与肠腺；称取10g虾仁加入到90mL PBS缓冲液中，均质器均质1min，200目绢布过滤，取滤液1000rpm离心10min，去沉淀，上清液10000rpm离心5min，收集菌体重悬浮于TE中，-20℃保存备用。