[发明专利]一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR‑DGGE分析方法

权利要求书

1.一种虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)、虾仁样品的预处理及菌体收集；

(2)、提取虾仁样品中微生物总DNA；

(3)、以提取的微生物总DNA为模板，进行细菌16S rRNA的PCR扩增，并检测；

(4)、将PCR产物进行DGGE电泳分析；电泳结束后染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱，在图谱上标记特异条带，切胶回收；

(5)、回收的DNA条带重新进行PCR扩增，然后测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性比对分析，确定细菌的归属，然后根据在DGGE图谱上标记的条带情况与鉴定出的细菌种类进行分析。

2.根据权利要求1所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)、虾仁样品的预处理及菌体收集；

(2)、采用细菌微生物DNA提取液进行虾仁样品中微生物总DNA的快速提取；

(3)、以提取的微生物总DNA为模板，采用16S rRNA基因V3高变区F357-GC和R518区具有特异性的引物对，进行细菌16S rRNA的PCR扩增，将PCR反应的产物用琼脂糖凝胶电泳检测；

(4)、将PCR产物进行DGGE电泳分析；电泳结束后染色、扫描仪成像，得到DGGE图谱，在图谱上标记特异条带，切胶回收；

(5)、回收的DNA条带重新进行PCR扩增，然后对产物进行测序，将测得的序列结果在NCBI数据库进行Blast同源性比对分析，确定细菌的归属，然后根据在DGGE图谱上标记的条带情况与鉴定出的细菌种类进行分析。

3.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(1)的具体操作为：样品为南美白对虾，从养殖塘捕捞后放入水泥池充气暂养一个晚上，捕捞打包并且冰藏后运到实验室的无菌室，无菌操作去壳与肠腺；称取10g虾仁加入到90mL PBS缓冲液中，均质器均质1min，200目绢布过滤，取滤液1000rpm离心10min，去沉淀，上清液10000rpm离心5min，收集菌体重悬浮于TE中，-20℃保存备用。

4.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述细菌微生物DNA提取液的组成为：9g NaCl，0.1g SDS(十二烷基硫酸钠)，1mLβ-硫基乙醇，1000mL去离子水。

5.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(2)中所述DNA的快速提取方法为：取样品菌悬液1mL，15000rpm离心1min，倒去上清，加入50μL提取液涡旋混匀，沸水浴加热2min，15000rpm再次离心1min，上清液即为DNA溶液。

6.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中引物对F357-GC和R518为：

7.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中反应体系为50μl总体积，ddH₂O 41.25μl，10×含2.0mM MgCl₂的Buffer 5μl，10mM的dNTP 1μl，10μM的F357-GC 1μl，10μM的R518 1μl，5U/μl的Taq酶0.25μl，模板DNA 0.5μl。

8.根据权利要求2所述的虾仁低温贮藏过程中特定腐败菌的PCR-DGGE分析方法，其特征在于，步骤(3)中反应程序为：94℃4min预变性；94℃0.5min；56℃1min；72℃0.5min；30Cycles，72℃延伸7min；取PCR产物各3μl，1.5％琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，120V稳压电泳30min，凝胶成像仪拍照。