[发明专利]一种基于熔解曲线法单管同时检测多种呼吸道病毒的引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种基于荧光探针熔解曲线法同时检测多种呼吸道病毒的方法，这7种病毒包括：甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)、呼吸道合胞病毒B型(RSVB)、鼻病毒(RV)、柯萨奇病毒B型(CoxB)、腺病毒(AdV)。

背景技术

急性呼吸道感染是临床最常见的疾病之一，可以在任何性别、年龄和地域发生，尤其在老年人和婴幼儿中有较高的发病率和死亡率，严重影响人的身体健康，给社会带来严重的经济损失。仅20世纪，全球就有超过1亿人因感染流感病毒而死亡。急性呼吸道感染可由细菌、病毒和支原体感染引起，呼吸道病毒是其中主要病原体。由于病毒颗粒小，容易通过呼吸道进行传播，且传播速度快，容易造成大流行。另外病毒容易发生突变，产生新的高致病性病原体，感染力增强，混合感染率的概率提高。不同呼吸道病毒所引发的症状和流行特点相似，临床上难以区分从而进行准确诊治。因此，准确鉴定呼吸道病毒的病原体对于制定治疗和用药方案、控制呼吸道病毒的传播具有重要意义。

对于呼吸道病毒感染的诊断，其常用的检测方法有以下几种：1、病毒分离培养法，是病毒诊断的“金标准”，缺点：费时费力，且需要有经验操作者；生物安全风险较高。2、免疫学检查，是临床门诊检验常用的方法，该方法操作简单、快速、费用低，但灵敏度特异性不高，病毒抗原发生变异时出现假阴性结果，且一个检测只能针对其中一种病原体。3、分子生物学方法，其优点是：灵敏度高，特异性强，但目前采用的普通荧光PCR检测一般一次只能检测一种病毒，通过重复多次实现对所有病原体的检测，而多通道荧光检测单管最多只能检测3-5个，无法满足一次进行多种病原体的检测。由此可见目前急需一种灵敏、特异、快速、简便的呼吸道病毒的多病原体检测的方法，以便能满足临床诊断、卫生防疫、传染病流行病学研究的需要。

Tem-PCR(Target enriched multiplex PCR靶序列富集多重PCR技术)是一种多重PCR技术，能在一次反应中对多种靶序列进行扩增和检测，本发明基于Tem-PCR技术，经荧光分子信标检测通过Tm值分析来实现对多种病原体的同时检测。

发明内容

本发明的目的是解决多种呼吸道病原体的同时检测，提供一种同时扩增和检测7种呼吸道病毒的引物、探针。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种基于熔解曲线法单管同时检测多种呼吸道病毒的引物，包括SEQ ID NO.1～8所示的反转录引物、SEQ ID NO.9～26所示的扩增引物、SEQ ID NO：27～28所示的启动扩增的通用引物、SEQ ID NO.29～35所示的分子信标探针，所述每条分子信标探针的两端分别带有荧光基团和猝灭基团。所述反转录引物在一次检测中共同使用，其中，腺病毒为DNA病毒，无需反转录。

其中，所述的病毒包括：甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒A型、呼吸道合胞病毒B型、鼻病毒、柯萨奇病毒B型、腺病毒。

其中，所述荧光基团为FAM、HEX或者Cy5，所述淬灭基团为DABCYL。

上述基于熔解曲线法单管同时检测多种呼吸道病毒的引物在检测呼吸道病毒中的应用。

进一步的，所述通用引物在扩增体系中的终浓度为0.1uM；所述加尾特异性上游引物浓度为0.02uM，加尾特异性下游引物浓度为0.2uM；分子信标探针浓度为0.2uM。

进一步的，所述PCR检测程序，具体程序如下：

热启动：95℃15min；

富集阶段：94℃30s，52℃1min，72℃1min(15cycles)；

加尾扩增：94℃15s，70℃1.5min(6cycles)；

PCR扩增：94℃15s，52℃15s，72℃15s(55cycles)；

延伸阶段：72℃3min；

熔解分析：95℃1min，37℃5min，80℃～30℃0.1℃/s。

进一步的，所述检测方法，根据熔解曲线的Tm峰值，进行分型。

本发明提出的检测7种呼吸道病毒的方法，通过以下技术方案实现：