[发明专利]苤蓝基因及其在培育紫色微型番茄中的应用

说明书

本发明公开了苤蓝BoPAP2和BoTT8基因及其共表达载体和应用，苤蓝BoPAP2基因的序列如SEQ ID No.3所示，苤蓝BoTT8基因的序列如SEQ ID No.6所示，将苤蓝BoPAP2和BoTT8基因共表达载体导入微型番茄(Micro‑Tom)外植体并获得稳定的遗传转化株系。转基因番茄植株呈现花青素在叶，花，根和果实等组织大量积累的表型，尤其是成熟期果实因花青素大量合成积累而呈现黑紫色。新创制的微型番茄品种具有良好的市场推广前景和经济价值，同时为其它观赏植物的新品种培育和筛选提供了良好的参考和借鉴。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及苤蓝基因及其在培育紫色微型番茄中的应用。

背景技术

由于富含番茄红素和β-胡萝卜素等活性物质，因而具有抗氧化和预防癌症功能的番茄是一种广受欢迎的世界性蔬菜。原产南美洲的番茄大约在16世纪起就开始成为一种全球性的重要作物。从拉丁美洲引种到欧洲的番茄最早是作为观赏植物来栽培的。经过全世界育种工作者长期对番茄种质的发掘与创制，番茄的种质资源得到了极大地丰富。作为一种番茄突变体,微型番茄(Micro-Tom)保留了普通番茄的模式植物特征,且植株矮小、生命周期短,有利于节省室内空间、水费需要量小,因而更适合用于观赏植物的培育。目前用于观赏植物培育的微型番茄叶片和果实色彩较为单一，从而限制了微型番茄作为观赏花卉的产业发展。传统育种一般通过杂交来培育新品种，而该方法周期长、耗资多、育种效果并不理想且目标难以预期。

发明内容

鉴于以上内容，本发明独辟蹊径，通过大量、繁杂的试错和筛选工作，选用来自苤蓝的特定基因，成功将其导入微型番茄中，意外发现，外源基因在微型番茄中成功表达，进而得到了紫色微型番茄。

本发明的目的之一在于提供两个苤蓝基因BoPAP2和BoTT8；苤蓝BoPAP2基因，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；苤蓝BoTT8基因，核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明的目的之二在于提供含苤蓝基因BoPAP2和/或BoTT8的重组载体，如含有两个苤蓝基因BoPAP2和BoTT8的基因共表达载体；优选的，所述的基因共表达载体是以pBIN121载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入依次连接的CaMV35S启动子、BoPAP2开放阅读框、Nos终止子、Nos终止子、BoTT8开放阅读框和CaMV35S启动子而构建成的。

所述基因共表达载体的制备方法，作为示例，可包括如下步骤：

a.以含有SEQ ID No.3的BoPAP2基因的重组质粒为模板，以SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8为引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后用Sac I和Xba I进行双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoPAP2；

b.以含有SEQ ID No.6的BoTT8基因的重组质粒为模板，以SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10为引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后用SacI和XbaI双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8；

c.以重组质粒pBI121::BoPAP2为模板，以SEQ ID No.11和SEQ ID No.12为引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后用EcoRI酶切，再与经同样酶切的pBI121::BoTT8载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8::BoPAP2，即为双基因表达载体。

所述含SEQ ID No.3的重组质粒，作为示例，可由如下方法制备：提取苤蓝幼叶总RNA，再以反转录得到的cDNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物进行扩增，将扩增产物与pMD-T载体连接，得含SEQ ID No.3的重组质粒。