[发明专利]苤蓝基因及其在培育紫色微型番茄中的应用

权利要求书

1.基因共表达载体，其特征在于：其为SEQ ID No.3所示BoPAP2和SEQ ID No.6所示BoTT8基因的共表达载体，所述共表达载体是以pBIN121载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入依次连接的CaMV35S启动子、BoPAP2开放阅读框、Nos终止子、Nos终止子、BoTT8开放阅读框和CaMV35S启动子而构建成的。

2.微生物转化体，其通过将权利要求1所述的基因共表达载体转化农杆菌LBA4404制得。

3.紫色微型番茄的培育方法，包括将SEQ ID No.6所示的苤蓝基因BoTT8和SEQ IDNo.3所示的苤蓝基因BoPAP2导入微型番茄中共表达。

4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述共表达的实现方式为苤蓝基因BoPAP2与BoTT8形成权利要求1所述的基因共表达载体，或形成权利要求2所述的微生物转化体。

5.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述紫色微型番茄相比导入所述苤蓝基因前的微型番茄，在微型番茄选自幼叶、成熟叶、幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及茎的至少一处部位，表现出下述至少一种特征：

1)上调微型番茄基因SlDFR和/或SlANS的表达水平；

2)提高微型番茄中花青素和/或花色苷的含量。

6.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述紫色微型番茄相比导入所述苤蓝基因前的微型番茄，在下述至少一处部位表现地更紫：幼叶、成熟叶、幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及茎。

7.根据权利要求3-6任一项所述的培育方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

a、制备含有微生物转化体的悬浮液

b、切取番茄子叶获得番茄外植体

c、将经过预处理的番茄外植体浸泡于所述微生物转化体的悬浮液中进行侵染

d、将侵染后的外植体在MS固体培养基中进行培养和筛选，直至脱分化长出具有卡那霉素抗性的再生芽

e、将所述具有卡那霉素抗性的再生芽切下，转入含有卡那霉素的生根培养基中，得到能够生根的阳性株系

f、对阳性株系进行PCR鉴定筛选，得到转基因的紫色微型番茄株系。

8.权利要求2所述的微生物转化体的制备方法，包括如下步骤：

a、通过低温CaCL₂处理的方法制备LBA4404感受态细胞

b、将权利要求3所述的基因共表达载体与LBA4404感受态细胞混匀

c、通过冻融法将基因共表达载体导入所述感受态细胞

d、将转化的细胞培养物涂布在含抗生素的YEB固体平板培养基

e、倒置培养直至形成单菌落

f、挑取单菌落，用含有抗生素的YEB液体培养基震荡培养

g、提取震荡培养得到的菌株的质粒，酶切提取的质粒，鉴定得到含有所述基因共表达载体的工程菌株。

9.权利要求1所述的基因共表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.以含有所述基因BoPAP2的重组质粒为模板，以SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的引物进行PCR扩增，将扩增产物用Sac I和Xba I双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoPAP2；

b.以含有所述基因BoTT8的重组质粒为模板，以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物进行PCR扩增，将扩增产物纯化后用Sac I和Xba I双酶切，再与经同样双酶切的pBI121载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8；

c.以重组质粒pBI121::BoPAP2为模板，以SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的引物进行PCR扩增，将扩增产物用EcoR I酶切，再与经同样酶切的pBI121::BoTT8载体连接，获得重组质粒pBI121::BoTT8::BoPAP2。