[发明专利]基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法

说明书

本发明涉及一种基于RET基因构象变化引起荧光染料硫黄素T荧光强度变化的温度计的构建，具体为：将荧光染料硫黄素T（ThT）和RET按1:1的摩尔比混合，加入Tris‑HCl缓冲溶液，调整pH=7，8和9。本发明构建的体系对pH和温度有明显响应，尤其在pH为7、8、9时，随温度升高，ThT的荧光强度有规律的下降，据此可设计成温度计。因为人体内pH在7左右，所以针对pH=7，在25‑40℃之间，设计成“体温计”。

技术领域

本发明涉及基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，基本为基于RET基因构象变化引起荧光染料ThT荧光强度变化来指示温度变化的温度计的构建方法。

背景技术

温度计，是测温仪器的总称，可以准确的判断和测量温度。通常利用固体、液体、气体受温度的影响而热胀冷缩等的现象为设计的依据。有煤油温度计、酒精温度计、水银温度计、气体温度计、电阻温度计、温差电偶温度计、辐射温度计和光测温度计、双金属温度计等多种温度计。大多是利用物质的物理性质来设计温度计用于不同的环境中。

RET蛋白是一种受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase),，一种原癌基因，对氢离子有响应，在弱酸环境里，会折叠成i-motif结构。人端粒存在富含胞嘧啶（C）的脱氧核苷酸（DNA）序列，这些序列在酸性环境中能通过胞嘧啶（C）与质子化胞嘧啶CH⁺之间的氢键相互作用形成平行双链，两条双链反平行相互插入所形成的四链非共价复合物，称为结构。结构多存在于原癌基因的启动子区域，如血管内皮生长因子、原癌基因以及成视网膜细胞瘤基因等，使其成为基因调控和抗癌药物设计的靶点。

硫黄素T（ThT）又称碱性黄1，2-[4-(二甲基氨基)苯基]-3,6-二甲基苯并噻唑鎓氯化物，分子式是C₁₇H₁₉ClN₂S，是一种化工染料。RET为发卡结构时，ThT与RET结合，有荧光发射，当RET变为i-motif结构时，ThT与RET分离，无荧光。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，高效灵敏、简单、快速的基于RET基因构象变化引起荧光染料ThT荧光强度变化来指示温度变化的温度计的构建方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，按下述步骤：

第一，荧光染料ThT和RET基因摩尔比为1：1，在Tris-HCl缓冲溶液中培养形成体系，通过改变Tris-HCl缓冲溶液的pH值，分别控制体系的pH值为7、8和9；

第二，在温度4-55℃范围内，每间隔3℃恒温培养30分钟；

第三，检测荧光，参数设置为狭缝10nm，电压500V，获得各温度梯度荧光强度参数。

本发明机理是：在弱酸性环境下，RET基因会折叠成i-motif结构，当RET基因为发卡结构时，在体系中荧光染料ThT与RET基因结合，处于发卡结构的空穴区内，ThT有荧光发射。

所述的基于荧光染料ThT、RET基因的温度计的构建方法，在弱酸性环境下，利用RET基因会折叠成i-motif结构，RET基因在pH=7、8、9时随温度而发生构象变化的温度为Tm，当RET基因为发卡结构时，荧光染料ThT与RET基因结合，处于发卡结构的空穴区内，引起荧光染料ThT荧光强度的变化，对温度有明显响应。

当温度升高超过其构象变化的温度时，ThT荧光强度下降，推测发卡结构解开变成单链结构，此时ThT与RET分离。

本发明可利用上述的构建方法设计一种基于荧光染料ThT、RET基因的温度计。