[发明专利]自然杀伤细胞活性测定方法

说明书

一种自然杀伤细胞活性测定方法，在效应细胞与靶细胞比例计算时引入“NK细胞比例”及“有核细胞活率”参数，并且在各环节进行质量控制，降低了检测差异性。

技术领域

本发明涉及一种自然杀伤细胞活性测定方法，属于生物检测领域。

背景技术

NK细胞(Natural killer cells，NK cell，自然杀伤细胞)最初因为无需预先致敏便可杀伤自体肿瘤细胞，而被称为天然免疫淋巴毒性细胞。经过数十年来对其表型及功能的细致研究，发现NK细胞的主要生物学功能主要有分泌细胞因子参与免疫调节及对靶细胞的直接杀伤作用[1，2]。NK细胞分布在不同组织中功能各异，不仅具有抗肿瘤、参与各种病理过程、维持免疫稳态，还可促进妊娠期胎盘血管形成过程。与之相应，恶性肿瘤、各种感染、自身免疫性疾病等均涉及NK细胞紊乱[3-6]。

NK细胞杀伤活性是评价免疫状态的重要指标，可用于监测免疫治疗过程中免疫状态的改变等方面。已有文献报道，其还与恶性宫颈癌化疗疗效、胰腺癌化疗后生存情况及阿尔茨海默病进展速度相关[7-9]。在家族性或获得性噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、炎症、自身免疫性疾病及免疫缺陷病中NK杀伤活性受损是其特点之一，但由于该指标各实验室结果无法比较，缺少正常参考值范围，在相关疾病诊断中常作为其他诊断指标的确证指标[10]。NK杀伤活性检测急需严谨、标准化的检测分析方法及相应正常参考值范围，解决其应用的瓶颈问题。

NK杀伤检测方法的“金标准方法”是51Cr释放实验，但由于放射性污染等问题限制了其在临床检测中的应用[11，12]。其他用于NK细胞杀伤活性检测的方法还包括低毒染料Calcein-AM释放实验、LDH释放实验、基于流式细胞术或生物发光的检测方法[13-17]。其中基于流式细胞术的检测方法具有操作简便、稳定、污染少、基线低且与51Cr释放实验方法相关性好等优点，现临床多采用此方法进行NK细胞杀伤活性检测[14，18]。

但现有技术的方法仅以有核细胞数与靶细胞数计算，可能会导致检测结果的偏移，无法实现对NK细胞杀伤能力的严谨评估。

发明内容

本发明提供一种自然杀伤细胞活性测定方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将靶细胞传代培养；

2)对效应细胞中自然杀伤细胞比例进行分析；

3)将靶细胞与效应细胞按照设定的效靶比进行培养；

4)检测步骤3)中待测靶细胞死亡率；

5)将步骤4)中靶细胞死亡率带入公式计算自然杀伤细胞活性：

自然杀伤细胞活性＝(待测靶细胞死亡率-对照组靶细胞死亡率)/(1-对照组靶细胞死亡率)×100％。

进一步地，步骤3)中的效靶比为4以上。

进一步地，步骤1)中对传代细胞进行密度和/或死亡率的质量控制。

进一步地，步骤2)中对效应细胞进行细胞密度、活细胞率及自然杀伤细胞比例至少之一的质量控制。

进一步地，所述质量控制方法包括将传代培养的靶细胞进行染料标记。

进一步地，包括用抗体对自然杀伤细胞进行标记。

进一步地，控制靶细胞自然死亡率在3％以内。

进一步地，靶细胞与效应细胞FH1通道MIF(平均荧光强度)值之比为80倍以上。

进一步地，步骤4)中，舍弃如下检测度数：与仅有靶细胞对照管相比，效靶细胞混合孵育检测管内靶细胞浓度低于前者85％。

进一步地，依据检测对象是否患过肿瘤选择效靶比。