[发明专利]一种基于油滴生成技术的转基因玉米高通量检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于油滴生成技术的转基因玉米高通量检测方法。

背景技术

转基因作物的研制和管理是世界各国都非常关注的问题。我国同样高度重视转基因植物安全管理，2001年5月23日颁布了《转基因生物安全管理条例》，之后国家质量监督检验检疫总局等部门制定了《出入境转基因产品检验检疫管理办法》加强对转基因作物的监管力度。

转基因检测多以外源DNA为目标，检测方法包括普通PCR、荧光定量PCR、southern杂交等技术。然而，基于PCR技术的检测方法通常每管只能进行一对引物的反应，无法摆脱通量低的缺点。常规的多重PCR反应，由于一个反应管中的引物过多会产生相互的干扰并且产生引物多聚，会对靶标DNA的扩增产生干扰，有时还会出现假阳性的情况。基于芯片技术的检测方法，可以实现高通量、高灵敏等要求，但对于转基因特殊目标基因的检测还需要对芯片进行特制，操作较为繁琐。

发明内容

本发明基于油滴生成技术建立新型的多重PCR，实现多重靶标DNA的扩增，并于高灵敏度的毛细管电泳检测技术相偶联，提高转基因多重检测的检测极限。本发明旨在利用本技术实现更大规模地筛选靶基因，进而对转基因作物进行大范围覆盖。

一种基于油滴生成技术的转基因玉米高通量检测方法，按照如下步骤进行：

1)转基因玉米基因组DNA模板的提取；

2)采用油滴生成器制备多重油滴；

3)多重油滴定性PCR反应；

4)多重油滴定性PCR扩增产物的纯化；

5)多重油滴定性PCR扩增产物毛细管电泳分离；

6)毛细管电泳图像采集；

7)进行多重样品分析，获得样品最优结果。

所述步骤1)中的转基因玉米基因组DNA提取是用TianGen Plant Genomic DNA Kit(Cat.#DP-305)试剂盒对转基因玉米标准物质(AOCS,IRMM)进行提取。

所述步骤1)后可设置多重油滴PCR反应体系的优化；根据不同目的片段的大小以及相对引物的扩增效率进行优化，选出最优的反应体系以及反应条件。

所述步骤2)中油滴生成器采用Bio-Rad公司QX200Auto DG Droplet Digital PCR System，油包水反应体系大小均匀，直径1nm。

所述步骤4)中多重油滴定性PCR扩增产物为油水混合物，采用TianGen公司Universal DNA Purification Kit(Cat.#DP214-02)试剂盒进行纯化。

所述步骤5)对于多重油滴定性PCR反应纯化产物进行毛细管电泳定量分离的仪器为Agilent 2100Bioanalyzer system。

所述步骤6)中毛细管电泳图像采集方法为：采用Agilent 2100 Bioanalyzer system软件对不同扩增产物阈值以及Maker进行设定，最终形成可见的峰图电泳图。

所述步骤7)中多重样品分析：对于20-32种不同转基因玉米目的片分为4组，分别进行4-6重油滴PCR，对于不同组进行分别优化，实现20-32种同时检测。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过油滴生成技术，建立新型多重PCR反应，实现多重靶标DNA的扩增，并与高灵敏度的毛细管电泳检测技术相偶联，提高转基因多重检测的检测极限。本发明旨在利用本技术实现更高大规模地筛选靶基因，进而对转基因作物进行大范围覆盖。本发明提供基于油滴生成技术对转基因玉米进行高通量检测的方法，包括转基因玉米材料挑选、多重油滴PCR扩增、产物的纯化和毛细管电泳及图像采集分析。

附图说明

图1是提取的样本DNA定性PCR产物电泳图(编号1-11)；

图2是提取的样本DNA定性PCR产物电泳图(编号1-12)；

图中，M：100bp Maker；1-22：59122、MIR162、NK603、BVLA430101、ZSSIIb、CaMV35S、MIR604、T-NOS、C0030.3.5、MON89034、C0030.3.7、SK12-5、Bt176、NPTII、4114、T25、MON810、MON87460、MON863、bar、TC1507、Bt11特异性片段；

图3是毛细管电泳图像；

图4是毛细管电泳图像；

图中，L：Ladder；1-12：多重PCR结果，12个重复。

具体实施方式