[发明专利]一种微生物谷氨酰胺转胺酶稳定性的检测方法

说明书

本发明公开了一种微生物谷氨酰胺转胺酶MTGase稳定性的检测方法，将MTGase溶液pH调节至5.0‑6.0，然后进行阳离子交换层析；洗脱缓冲液pH为8.0‑9.0，洗脱方法为线性洗脱，经平衡缓冲液和洗脱缓冲液pH梯度洗脱，分离得到MTGase的两个同分异构体(MTGase I1和MTGase I2)，根据MTGase I2/MTGase I1的比值可以测定MTGase的稳定性。本发明还公开了一种MTGase同分异构体的分离方法。本发明方法简单、快捷，灵敏度高，为MTGase的生产品控环节提供更方便、快捷、可靠的检测方法，同时对MTGase后期应用稳定性的控制提供技术保障。

技术领域

本发明涉及酶制品稳定性的检测，具体涉及一种MTGase稳定性的检测方法，属于酶学性质及分离纯化领域。

背景技术

谷氨酰胺转氨酶(Transglutaminase，简称TGase，EC2.3.2.13)是一种催化酰基转移的转移酶，可催化蛋白质分子内和分子间ε-(γ-glutaminyl)lysine共价键的形成，从而催化蛋白质分子内、分子间发生交联，进而改变蛋白质的性质和功能。谷氨酰胺转氨酶广泛存在于植物、动物和微生物中。而微生物来源的谷氨酰胺转胺酶(microbialtransglutaminase,MTGase)相对于动植物来源的TGase，具有非钙离子依赖性、底物特异性低、成本低等特点，使得MTGase在各个领域得到广泛的应用，如应用于肉制品、水产制品、乳制品、植物蛋白等食品加工方面，主要是改变食品的机械性能、持水性、口感等性能。近年来，MTGase在纺织领域及生物医学领域也有着越来越广泛的应用，如MTGase被大量用于蛋白质或多肽与小分子、聚合物、化学材料、DNA及其他蛋白等物质的结合。很多研究者利用MTGase的交联性质，对治疗药物蛋白进行位点特异性修饰等。在纺织工业中，MTGase多用于羊毛织物的处理，还用于牛仔服饰的做旧处理等；羊毛中含有谷氨酰胺和赖氨酸残基，添加TGase可以减少加工过程中的纤维损伤和褪色情况。

MTGase由于其化学本质为蛋白质，其本身在生产、销售和应用过程容易受各种因素影响而使酶活降低，所以在工业上提高MTGase的稳定性是所要解决的重大问题，需要在每个生产环节做到严格的把控。有学者致力于优良菌株的筛选，从而得到产稳定性较好的菌株；有学者则致力于菌株发酵工艺的优化，从而得到稳定的发酵工艺，减小发酵过程中的不稳定因素对MTGase稳定性的影响；有学者致力于发酵后工艺的优化，在发酵后处理中加入不同的稳定剂来保护MTGase，研究表明添加合适糖类、盐离子、氨基酸等物质可以提高MTGase的稳定性，从而减小发酵后处理对MTGase的影响；同时也有学者致力于MTGase长期稳定保存的研究，如降低保存温度，调节液体MTGase产品在合适的pH值，添加保护剂来增加MTGase的稳定性，延长保质期(专利公开号：CN 104024406A、CN 105462950A、CN 1684593)。

尽管很多学者对于MTGase的稳定性做了很多研究，但是在实际的生产和应用中仍然存在很多问题，如：(1)由于发酵工艺的不稳定，造成每批次发酵得到的MTGase稳定性存在一定差异；(2)MTGase本身为蛋白质，即使在发酵后处理、运输过程中严格控制操作环节，其稳定性仍然会受到外界不稳定因素的影响；(3)医药领域对MTGase的纯度、稳定性等方面有着严格的要求，MTGase的精细纯化过程可能会对MTGase的稳定性有影响，需要严格精确的稳定性鉴定方法来对符合要求的MTGase进行筛选；(4)目前MTGase粉末制剂虽然已经实现规模化生产，但生物酶制剂及各工业领域在向液体剂型发展，而液体状态下MTGase的稳定性相对于固体状态更不稳定，使得鉴定液体MTGase的稳定性成为更加关注的问题。

据文献报道，由于蛋白质在折叠组装时的差异，同种蛋白质会存在不同的同分异构体，特别是生物医学领域所用到的抗体，不同的同分异构体抗体蛋白会有明显的性质差异，所以会对蛋白的同分异构体进行分离。通过我们的实验发现，MTGase也存在同分异构体，用阳离子交换层析方法进行pH梯度洗脱可以将MTGase的同分异构体进行分离。经过酶学性质检测发现，MTGase I1和MTGase I2在温度稳定性、pH稳定性、保存稳定性等方面存在显著的差异。