[发明专利]一株高产γ‑氨基丁酸的米根霉菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉生物技术领域，具体涉及一株高产γ-氨基丁酸米根霉菌株的筛选方法。

背景技术

γ-氨基丁酸的别名为氨酪酸或哌啶酸，化学名为4-氨基丁酸，其分子式为NH₂CH₂CH₂CH₂COOH，分子量为103.1。γ-氨基丁酸是中枢神经系统中很重要的抑制性神经递质，能促进脑的活化性，健脑益智，抗癫痫，促进睡眠，美容润肤，延缓脑衰老机能，能补充人体抑制性神经递质，具有良好的降血压功效。促进肾机能改善和保护作用。抑制脂肪肝及肥胖症，活化肝功能。每日补充微量的伽玛氨基丁酸有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢的平衡，调节免疫功能。因此，γ-氨基丁酸成为重要的医药与保健原料。γ-氨基丁酸结构式为：

目前，γ-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法、微生物发酵法、植物富集法等。其中，化学合成方法成本高产率低，且在生产过程中涉及到有毒溶剂，存在化学试剂残留，因此安全方面存在隐患；植物富集法依赖于种植业，收到气候、地域等影响较大，产量不稳定，难以满足日益增长的需要。微生物合成法主要是利用微生物发酵，通过筛选优良、高产且稳定的微生物菌株，发酵生产γ-氨基丁酸，主要包括乳酸菌、酵母菌、曲霉菌、谷氨酸棒状杆菌等。然而，目前通过微生物发酵生产γ-氨基丁酸的产量还较低，主要有以下几个原因：(1)微生物培养成本过高，培养基比较昂贵，发酵设备投资较大；(2)由于γ-氨基丁酸是水溶性，因而从发酵产物中提取γ-氨基丁酸的工艺比较复杂。因此需要筛选新的能够生产γ-氨基丁酸的菌株。

米根霉是一种常见的霉菌，在自然界中分布十分广泛。米根霉在酿造中扮演着十分重要的角色，由于其能产生活性很强的淀粉酶，在酿酒工业上常用作淀粉质原料的糖化菌，我国最早利用根霉糖化淀粉(阿明诺法)生产酒精。米根霉在生长过程中能够产生苹果酸、γ-氨基丁酸、乳酸、柠檬酸、富马酸等多种有机酸，广泛应用于食品、医药、饲料以及环境等领域。因此可以采用根霉来生产γ-氨基丁酸，用于食品与医药行业。

本发明筛选到一株高产γ-氨基丁酸米根霉株，对该菌进行了鉴定，对生产γ-氨基丁酸的培养条件进行了初步研究，为微生物合成γ-氨基丁酸工业化提供了基础。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产γ-氨基丁酸的米根霉，并对其进行了分类学鉴定，该菌命名为Rhizopus oryzae Q1。对发酵产物γ-氨基丁酸进行了鉴定，为微生物合成γ-氨基丁酸的工业化提供了有益的指导。

为实现上述目的，发明人首次分离纯化到一株能够产生γ-氨基丁酸的新菌株。经过18S rDNA和生理生化鉴定，该菌株为米根霉(Rhizopus oryzae)，命名为米根霉Q1(Rhizopus oryzae Q1)。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年10月17日，保藏号为CCTCC M 2016565。

菌株的筛选：将采集的酒曲样品稀释至不同的浓度，分别吸取0.1mL不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，挑取生长的米根霉单菌落，转接与斜面培养基保藏；

γ-氨基丁酸的鉴定方法：将γ-氨基丁酸标样(购自Sigma公司，99％以上)配置成10mg/100mL的溶液。发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g，研磨捣碎，用0.02mol/L盐酸定容到100mL并过滤除去固体物质，取10mL溶液在日立L-8800全自动氨基酸分析仪上进行分析，60℃分析。

菌株的鉴定：提取米根霉Q1的基因组DNA，然后以该DNA样品作为扩增末班，使用真菌18S rDNA的通用引物进行序列扩增，PCR方法：PCR扩增条件为94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次。PCR体系组成：DNA模板0.2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，dNTPs溶液5μL，DNA聚合酶0.2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，去离子水19.1μL。取PCR产物1μL，加5μL Loading buffer，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，DNA Green染色后，在紫外灯下观察电泳条带。用凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，送到上海生工生物科技有限公司进行18S rDNA的测序，将测序结果与NCBI数据库中的已知序列进行比对分析。