[发明专利]一株高产γ‑氨基丁酸的米根霉菌株及其应用

权利要求书

1.一株高产γ-氨基丁酸的米根霉菌株，其特征在于：其分类命名为米根霉(Rhizopus oryzae)Q1，于2016年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2016565。

2.根据权利要求1所述米根霉株Q1的筛选方法，其特征是：

(1)菌株的筛选：将采集的酒曲样品稀释至不同的浓度，分别吸取0.1mL不同浓度的菌悬液涂布于筛选培养基上，挑取生长的米根霉单菌落，转接与斜面培养基保藏；

(2)γ-氨基丁酸的鉴定方法：将γ-氨基丁酸标样(购自Sigma公司，99％以上)配置成10mg/100mL的溶液；发酵物在50℃条件下烘干后，准确称量2.000g，研磨捣碎，用0.02mol/L盐酸定容到100mL并过滤除去固体物质，取10mL溶液在日立L-8800全自动氨基酸分析仪上进行分析，60℃分析；

(3)菌株的鉴定：提取米根霉Q1的基因组DNA，然后以该DNA样品作为扩增模板，使用真菌18S rDNA的通用引物进行序列扩增，

正向引物为P1：GTAGTCATATGCTTGTCTC；

反向引物为P2：CTTCCGTCAATTCCTTTAAG；

PCR方法：PCR扩增条件为94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30次；

PCR体系组成：DNA模板0.2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，dNTPs溶液1μL，DNA聚合酶0.2μL，10×PCR缓冲液2.5μL，去离子水19.1μL；取PCR产物1μL，加5μL Loading buffer，在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳，DNA Green染色后，在紫外灯下观察电泳条带；

用凝胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，送到上海生工生物科技有限公司进行18S rDNA的测序，将测序结果与NCBI数据库中的已知序列进行比对分析。

3.权利要求1所述米根霉应用于γ-氨基丁酸的生产，其特征在于采用所述米根霉Q1为出发菌株，接种到产孢子培养基中，30℃培养2-3天，至孢子成熟；采用无菌水洗下孢子，将孢子数稀释到10⁷个/mL；以1-5％的体积比将孢子悬浮液转接至发酵培养基，在30℃条件下培养5天。

4.根据权利要求2与3所述的应用，其特征是筛选培养基与产孢子培养基成分一样：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，自然pH。

5.根据权利要求3所述的应用，其发酵培养基成分为：糯米30g，谷氨酸0-0.6g，水5-30g，自然pH，121℃下灭菌20分钟。