[发明专利]一种适配体介导腺病毒靶向给药系统及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术药物技术领域，尤其涉及一种适配体介导腺病毒靶向给药系统及其构建方法。

背景技术

恶性肿瘤的传统治疗方法如手术和化疗，仍不能根治多数癌症。因肝癌具有高侵袭性和迁移性，因 此，其诊断非常困难。肝癌的手术切除率通常低于15％，但术后复发率却高达50％。此外，虽然化疗对 高度增殖的肿瘤细胞能发挥作用，并在开始治疗阶段缩小大部分肿瘤，但它并不能阻止因多药耐药所导致 的肿瘤复发和转移。再者，由于缺乏针对肿瘤干细胞的特定靶向制剂，由传统化疗所引起的致命性毒性和 副作用在所难免。

目前，肿瘤的基因治疗得到了人们的广泛关注，而寻找一种合适的载体用于基因治疗，是非常关键的。 但无论选择哪种载体，关键在于此载体在局部的表达效率。因为我们最终的目的是要在局部表达目的基因， 并且使其具有一定的作用。虽然腺病毒感染效率高，几乎可达100％，但由于腺病毒具有免疫原性，易引 起机体本身的免疫应答反应，因此，腺病毒在体内滞留时间较短，其基因表达在体内仅能维持1-2周，随 着细胞传代，外源基因会逐渐丢失而不能长时间稳定表达。另外，腺病毒有较大的宿主范围，其组织分布 的靶向性不强，因此到目前为止国内外进入临床研究的腺病毒基因治疗药物多采用局部(瘤内)注射的给 药方式，以避免腺病毒系统分布导致的对正常细胞和组织的毒性等不良反应，然而，由于肿瘤具有浸润、 转移的特性，局部给药只能作为一种辅助的治疗手段，不可能成为肿瘤药物治疗的主流。有研究表明携载 抑癌基因PTEN的重组腺病毒Ad5-PTEN能抑制肝癌，但由于上述腺病毒缺陷以及缺乏靶向性，使 Ad5-PTEN的应用受到了极大地限制。因此，对Ad5-PTEN进行结构改造或修饰，并将其制成靶向制剂， 以精准靶向肝癌细胞，促使药物聚集在肿瘤细胞，在彻底杀灭癌细胞的同时最大程度降低其毒副作用。

靶向制剂中，适配体介导的靶向制剂受到了人们的普遍关注。适配体(aptamer)是一类由RNA或 单链DNA寡核苷酸组成的小核酸分子，它对靶分子具有高特异性和高亲和力。因生物标志物的发现和 aptamer的优点，aptamer技术在各生物医学领域得到了广泛发展，包括体外诊断领域，体内成像和靶向治 疗等。尽管aptamer具有良好的靶向性能，但仍因其诸多缺点使适配体靶向制剂的临床应用受到了限制。 一是aptamer自身固有的性质，如构象灵活性和核酸酶的稳定性等。Aptamer主要通过形成二级或三级结 构与靶标结合，这可能受到诸如温度、pH、离子强度等体内环境微小变化的影响。此外，靶分子在体内的 构象可能会与体外有所不同，这种微小的变化可能会使aptamer无法正确识别靶分子，因而无法起到靶向 作用。二是aptamer的化学稳定性。在血液中，aptamer会迅速被血清核酸酶降解，这极大地限制了aptamer 在临床上的应用。除了上述自身特性，还存在与靶标结合的问题。虽然aptamer能够特异性结合不同的靶 标，但只有aptamer与靶分子在特定条件下结合后，才能发挥靶向作用。在体内，aptamer要避免网状内 皮系统和肾的清除聚集在肿瘤组织，通过与肿瘤细胞上的受体靶标结合后才能介导腺病毒药物颗粒进入肿 瘤细胞。因此，在实际的研究中，可采用一定手段增强aptamer的体内稳定性和延长其循环时间。

EpCAM在大多数实体瘤中过表达而在人类正常上皮组织中表达低，已被确认为肝癌的肿瘤干细胞表 面标记物，如HepG2细胞。而PTEN能够降低上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM) 阳性肝癌的复发率。因此，本发明中我们创新性的使用EpCAM阳性的RNA适配体EpDT3修饰Ad5-PTEN， 成功构建了新的基因给药系统EpDT3-PEG-Ad5-PTEN。此给药系统的构建中需解决以下几方面的关键问 题：1)如何对Ad5-PTEN进行修饰。一要确保目标物在保留Ad5的感染能力的同时最大限度地提高Ad5 的血清抗体中和性能，从而延长药物的半衰期；二要降低腺病毒的免疫原性。2)如何对核酸适配体EpDT3 进行修饰，以增强其体内外的稳定性并延长其体内循环时间。3)寻找合适的连接剂。4)反应条件的摸索 和合成流程的构建。EPAP是以双功能PEG作为连接剂，通过酰胺键将Ad5-PTEN与核酸适体EpDT3结 合而成，而在Ad5-PTEN的聚乙二醇化过程中，PEG两端的羧基都有可能被活化并与腺病毒反应而形成 Ad5-PEG-Ad5，最终将没有位置再连接适配体EpDT3而得到目标产物EPAP。因此，为了解决这一问题， 需要探索该反应的最佳条件，并从反应开始就严格控制反应物的比例。