[发明专利]一种适配体介导腺病毒靶向给药系统及其构建方法

权利要求书

1.一种适配体介导腺病毒靶向给药系统，其特征在于，所述适配体介导腺病毒靶向给药系统以PEG为连接臂，EpDT3修饰的Ad5-PTEN新基因给药系统EpDT3-PEG-Ad5-PTEN，所述EpDT3-PEG-Ad5-PTEN是EPAP。

2.一种如权利要求1所述适配体介导腺病毒靶向给药系统的制备方法，其特征在于，所述适配体介导腺病毒靶向给药系统的构建方法包括以下步骤：

步骤一，对重组腺病毒进行扩增、纯化和滴度测定，再用双功能PEG作为连接剂；

步骤二，利用酰胺反应原理，将PEG先后与Ad5-PTEN和EpDT3偶联成EPAP，并通过SDS-PAGE电泳法确认PEG-Ad5-PTEN的形成；

步骤三，通过荧光强度检测法、粒径及Zeta电位的测定和TBE-PAGE电泳法鉴定EPAP的形成。

3.如权利要求2所述的适配体介导腺病毒靶向给药系统的制备方法，其特征在于，所述适配体为RNA适配体；

采用的EpDT3为EpCAM阳性适配体；

EpDT3的3′末端以氨基修饰，

即5′-GCGACUGGUUACCCGGUCG-(CH2)6-NH2-3′，并作2′-氟嘧啶修饰；5′末端以FAM进行荧光标记。

4.如权利要求2所述的适配体介导腺病毒靶向给药系统的制备方法，其特征在于，所述适配体介导腺病毒靶向给药系统的构建方法包括以下步骤：

第一步，重组腺病毒表面蛋白与PEG偶联形成Ad5-PEG-PTEN，将100μLN-羟基琥珀酰亚胺NHS，3.75μM和100μL碳二亚胺盐酸盐与100μL COOH-PEG₂₀₀₀-COOH 1.5μM水溶液混合均匀；以2-乙基磺酸缓冲液调节反应液的pH值至6.0，室温下轻柔搅拌，孵育1h以活化COOH-PEG₂₀₀₀-COOH中的羧基；加入磷酸缓冲盐溶液，将反应液的pH值调整到7.2，立即向其中加入100μLAd5-PTEN1.5μM溶液，用蒸馏水定容到500μL；在37℃水浴中以300r/min反应2h，制得Ad5-PEG-PTEN粗产物；最后，用截留分子量为100kDa的超滤离心管以5000g/min的转速超滤离心10min，如此重复洗涤离心四次，以去除小分子物质，得到精制的Ad5-PEG-PTEN；

第二步，EpDT3与Ad5-PEG-PTEN通过酰胺键偶联形成EPAP，取100μL浓度为3.75μM的精制Ad5-PEG-PTEN，加入100μL浓度为11.25μM的NHS和100μL浓度为33.75μM的EDC，并混合均匀；以MES缓冲液pH 6.4将混合物pH值调整至6.0，轻柔搅拌，25℃孵育1h以活化精制PEG-Ad5-PTEN中另一个未反应的羧基，加入100μL EpDT3溶液3.75μM，以无RNA酶水将反应液稀释至500μL；37℃水浴中轻柔搅拌，避光反应2.5h，制得EpDT3-PEG-Ad5-PTEN粗产物；用截留分子量为100kDa的超滤离心管以5500g/min，超滤离心10min，重复洗涤离心四次，以去除未反应的小分子物质，得到精制的目标给药系统。