[发明专利]基于POCKITMicro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病的检测试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病的检测试剂盒及应用。

背景技术

细粒棘球蚴病蚴病是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，在我国四川、青海、甘肃、宁夏、新疆等地区普遍存在，其中牦牛、羊是其主要的中间宿主，牛羊感染细粒棘球蚴后一方面严重影响其生长性能，另一方面感染细粒棘球蚴的牛羊内脏不经处理被犬吞食是造成该病流行的关键环节。

目前基层对牛羊脏器是否感染细粒棘球蚴主要靠眼观手摸，具有很大的局限性，对于较小的包囊，或者其它寄生虫造成的疑似包囊(比如肝片吸虫、细颈囊尾蚴等)无法准确判定。而实验室检测主要是PCR方法，需要专门的仪器(PCR仪，离心机等)，基层检疫部门往往缺乏相应的仪器和技术人员，因此对牛羊内脏是否感染细粒棘球蚴的现场快速检测方法的建立就迫在眉睫。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病的检测试剂盒及应用，本发明是基于POCKIT Micro平台的荧光PCR，操作简单、敏感性高、特异性强，可以现场对牛羊细粒棘球蚴病的检测提供科学依据，对保障人畜健康、提高公共卫生安全水平具有重要意义。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病检测的引物和探针，所述引物和探针包括：牛羊细粒棘球蚴病上游引物、牛羊细粒棘球蚴病下游引物和牛羊细粒棘球蚴病探针，其中，所述牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQ ID NO.3所示。

本发明还公开了一种上述的引物和探针在制备牛羊细粒棘球蚴病检测试剂盒方面的应用。

本发明还公开了一种基于POCKIT Micro荧光PCR的牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒，该试剂盒包括DNA模板、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；

所述荧光定量PCR反应液包括牛羊细粒棘球蚴病上游引物3.5μL，牛羊细粒棘球蚴病下游引物3.5μL，牛羊细粒棘球蚴病探针1.5μL，Taq酶1.5μL，预混buffer 25μL，去离子水14μL，总量为49μL，DNA模板与荧光定量PCR反应液的总量为50μL；

所述牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，Taq酶的终浓度为5U·μL^-1，牛羊细粒棘球蚴病上游引物和牛羊细粒棘球蚴病下游引物的终浓度均为400nM，牛羊细粒棘球蚴病探针的终浓度为250nM。

进一步地，阳性对照品为：含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，所述ND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述阴性对照品为：无ND1基因片段的pEASY-T1空载体。

进一步地，含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，由以下方法制备得到：

1)利用牛羊细粒棘球蚴病上游引物和牛羊细粒棘球蚴病下游引物，以细粒棘球绦虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因的PCR 扩增产物；

2)将PCR扩增产物克隆到pEASY-T1载体上，构建含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒；

3)抽提质粒，定量并稀释至10³拷贝/μl，制备得到含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，即为阳性对照品。

本发明还公开了一种上述的试剂盒定性检测牛羊细粒棘球蚴病的方法，包括以下步骤：

a)采用PetNAD核酸快速提取试剂盒从待检测的标本中提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为1.5ng/μl，制备得到DNA提取液；

b)以提取得到的DNA作为模板，加入到装有荧光定量PCR反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入等体积的阳性对照模板和阴性对照模板，将PCR管放置到POCKIT Micro荧光PCR仪中进行检测，42分钟以后判读结果。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明提供了一种牛羊细粒棘球蚴病的荧光PCR检测试剂盒，其优点是异性强、灵敏度高、无污染、无需电泳，可在现场快速检测。