[发明专利]基于POCKITMicro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病的检测试剂盒及应用

权利要求书

1.一种基于POCKIT Micro荧光PCR平台的牛羊细粒棘球蚴病检测的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：牛羊细粒棘球蚴病上游引物、牛羊细粒棘球蚴病下游引物和牛羊细粒棘球蚴病探针，其中，

所述牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的引物和探针在制备牛羊细粒棘球蚴病检测试剂盒方面的应用。

3.一种基于POCKIT Micro荧光PCR的牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括DNA模板、荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品；

所述荧光定量PCR反应液包括牛羊细粒棘球蚴病上游引物3.5μL，牛羊细粒棘球蚴病下游引物3.5μL，牛羊细粒棘球蚴病探针1.5μL，Taq酶1.5μL，预混buffer 25μL，去离子水14μL，总量为49μL，DNA模板与荧光定量PCR反应液的总量为50μL；

所述牛羊细粒棘球蚴病上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述牛羊细粒棘球蚴病下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述牛羊细粒棘球蚴病探针如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的基于POCKIT Micro荧光PCR的牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒，其特征在于，Taq酶的终浓度为5U·μL^-1，牛羊细粒棘球蚴病上游引物和牛羊细粒棘球蚴病下游引物的终浓度均为400nM，牛羊细粒棘球蚴病探针的终浓度为250nM。

5.根据权利要求3所述的基于POCKIT Micro荧光PCR的牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为：含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，所述ND1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述阴性对照品为：无ND1基因片段的pEASY-T1空载体。

6.根据权利要求5所述的基于POCKIT Micro荧光PCR的牛羊细粒棘球蚴病的试剂盒，其特征在于，含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，由以下方法制备得到：

1)利用牛羊细粒棘球蚴病上游引物和牛羊细粒棘球蚴病下游引物，以细粒棘球绦虫的基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得目的基因的PCR扩增产物；

2)将PCR扩增产物克隆到pEASY-T1载体上，构建含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒；

3)抽提质粒，定量并稀释至10³拷贝/μl，制备得到含有细粒棘球绦虫ND1基因片段的pEASY-T1载体质粒，即为阳性对照品。

7.权利要求3所述的试剂盒定性检测牛羊细粒棘球蚴病的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)采用PetNAD核酸快速提取试剂盒从待检测的标本中提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为1.5ng/μl，制备得到DNA提取液；

b)以提取得到的DNA作为模板，加入到装有荧光定量PCR反应液的PCR管中，对照PCR管中分别加入等体积的阳性对照模板和阴性对照模板，将PCR管放置到POCKIT Micro荧光PCR仪中进行检测，42分钟以后判读结果。