[发明专利]CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该功能单元的载体及其应用。本发明要解决的技术问题是：依据CRISPR/Cpf1系统的的作用原理及植物细胞基因表达特性，构建有效的植物基因组CRISPR/Cpf1定向修饰骨架载体，并实现其在植物基因组定向修饰中的高效应用。本发明的技术方案是：构建由一个毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)Cpf1核酸酶蛋白(LbCpf1)表达单元及一个向导crRNA转录表达单元构成的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体。本发明还提供了采用所述的CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰骨架载体，针对水稻基因组目标位点设计特异性向导crRNA并构建CRISPR/Cpf1重组表达载体的方法。本发明提供了一种高效的CRISPR/Cpf1植物定向修饰骨架载体，可以针对植物基因组目标序列有效实现基于CRISPR/Cpf1系统的简单、快捷、高效定向修饰。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种CRISPR/Cpf1植物基因组定向修饰功能单元、包含该框架的载体及其应用方法。

背景技术

基因组定向修饰一直是生物学研究的前沿与热点领域，通过对基因组特定区域进行精确定向修饰：一方面可以针对目标序列进行精确突变，获得突变材料，对目标基因功能进行明确鉴定；另一方面可以进行目标序列的精确置换或插入，将外源基因随机导入造成的表达及遗传的不确定性降至最低。自1996年起，研究者相继报道了ZFN(Kim et al.,1996)、TALEN(Christian et al.,2010)、CRISPR/Cas9(Jinek et al.,2012)的DNA定向剪切活性，被广泛应用于动物、植物基因组定向修饰中，极大推进了真核生物基因组工程的基础及应用研究。

最近发现的CRISPR/Cas9系统是(古)细菌中一类异于“限制-修饰系统”的对抗外源核酸分子入侵的基因组免疫系统：研究表明，在细菌中一个序列特异性的crRNA(CRISPRRNA)与另一tracrRNA分子(trans-activating crRNA)同源区域配对，之后可识别DNA双链中的同源序列，进而引导Cas9蛋白识别并切割目标DNA双链，形成定向DSB(Jinek et al.,2012)。自2013年，CRISPR/Cas9系统的细胞内源DNA定向修饰活性被证实以来，研究者采用CRISPR/Cas9系统在包括食蟹猴、斑马鱼、小鼠、人源细胞系、拟南芥、水稻等动植物系统中实现了基于RNA导向的基因组定向修饰。由于CRISPR/Cas9系统能够在活细胞中高效地、便捷地“编辑”任何基因，作为科研、医疗等领域的强有力工具，已被广泛地应用于全世界的生物及医学实验室。尽管CRISPR比之前的基因编辑方法要简单得多，也被认为是遗传研究领域的革命性技术，但研究者依然没有放弃CRISPR技术的改进及拓展工作，希望能够实现更简单、更精准的目标基因组定向修饰。