[发明专利]用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株、方法及应用

说明书

技术领域：

本发明具体涉及包括利用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株、方法及应用，属于生物工程发酵技术领域。

背景技术：

豌豆是制取粉丝用淀粉的主要豆类产品之一，含有丰富的淀粉、蛋白质和膳食纤维。在我国，除少量豌豆用来直接食用外，约98%的豌豆用来加工成淀粉、蛋白和生产粉丝。无论是传统的“酸浆法”豌豆淀粉生产工艺，还是现代的豌豆蛋白、豌豆淀粉生产工艺过程中都会产生大量废水，造成严重的环境污染。目前我国豌豆粉丝生产企业中，每生产一吨豌豆粉丝会产生13-15吨废水，而“粉丝之都”招远每年产生的粉丝废水高达600万吨。这些废水中含有丰富的蛋白质，膳食纤维，低聚糖等多种营养物质，COD、BOD、SS等指标特别高，此类污水治理难度非常大，投入成本很高，同时造成了资源的严重浪费。

枯草芽孢杆菌大量应用于生物肥料，当作用于作物或土壤时，能够在作物根际或体内定殖，并起到特定肥料效应，在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用方面广泛应用，既能够保护环境，又可以提高农作物产品品质和食品安全。

目前已有的枯草芽孢杆菌液体生物肥料菌剂有固态发酵生产工艺和液体发酵生产工艺两种。固态发酵生产工艺很难做到纯种发酵，且劳动强度大、生产环境恶劣；液态发酵生产工艺生产方式先进，但生产成本高、售价高，限制了产品的推广应用。另外有的枯草芽孢杆菌没有经过专项选育，肥效不好。

发明内容：

本发明的目的在于提供用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株、方法及应用，高质化解决豌豆蛋白厂废水的综合利用问题。

本发明的技术方案：本发明用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株为纳豆枯草芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus subtilis LD-9308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13465，保藏日期：2016年12月19日。

用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）菌种活化：

采用斜面培养基对保存的纳豆枯草芽孢杆菌种进行活化，菌种活化用的斜面培养基为固体LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，余量水，pH 7.0-7.5；

在斜面培养基上无菌操作，划线，置于37℃的培养箱内培养10-24小时，备用；

（2）摇瓶种子制备：

摇瓶种子培养基 (g/L)：葡萄糖 10-20，蛋白胨 5-15，酵母提取物 3-5， KH₂PO₄ 1-3，MgSO₄ 0.2-0.5，余量水，pH 6.5-7.5；

250ml三角瓶装液量为20-50ml，500ml三角瓶装液量为40-80ml，115℃灭菌20-30分钟；

在超净工作台上，无菌操作接种三角瓶培养基，每瓶接种一环上述活化后的菌种，置于恒温摇床37℃培养，摇床转速200-250 rpm，培养时间6-15小时；

（3）发酵种子罐液体菌种制备：

发酵罐种子培养基(g/L)：葡萄糖5-25，硫酸铵5-10，余量为豌豆蛋白废水，以氨水调节pH 6.5-7.5；

115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种摇瓶种子，接种量0.5%-2.0%（V/V）；

培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250 rpm，通气量1：0.2-0.5,培养时间6-12小时；

（4）发酵培养：

发酵培养基：豌豆蛋白废水，pH 6.5-7.5；

115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种种子罐液体菌种，接种量1%-3%（V/V）；

培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250 rpm，通气量前10小时1：0.2-0.3,后期1：0.3-0.5,培养时间15-25小时，菌体浓度达到2.0×10⁹ CFU/mL以上。

用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂在生物肥料的应用，生产的液体菌剂稀释200倍后,以灌根法施肥于西红柿、黄瓜等蔬菜作物，显示出显著的增产、抗病效果。