[发明专利]用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株、方法及应用

权利要求书

1.用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的菌株，其特征在于其为纳豆枯草芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus subtilis LD-9308，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.13465，保藏日期：2016年12月19日。

2.用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

菌种活化：

采用斜面培养基对保存的纳豆枯草芽孢杆菌种进行活化，菌种活化用的斜面培养基为固体LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，琼脂粉15，余量水，pH 7.0-7.5；

在斜面培养基上无菌操作，划线，置于37℃的培养箱内培养10-24小时，备用；

摇瓶种子制备：

摇瓶种子培养基 (g/L)：葡萄糖 10-20，蛋白胨 5-15，酵母提取物 3-5， KH₂PO₄ 1-3，MgSO₄ 0.2-0.5，余量水，pH 6.5-7.5；

250ml三角瓶装液量为20-50ml，500ml三角瓶装液量为40-80ml，115℃灭菌20-30分钟；

在超净工作台上，无菌操作接种三角瓶培养基，每瓶接种一环上述活化后的菌种，置于恒温摇床37℃培养，摇床转速200-250 rpm，培养时间6-15小时；

发酵种子罐液体菌种制备：

发酵罐种子培养基(g/L)：葡萄糖5-25，硫酸铵5-10，余量为豌豆蛋白废水，以氨水调节pH 6.5-7.5；

115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种摇瓶种子，接种量0.5%-2.0%（V/V）；

培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250 rpm，通气量1：0.2-0.5,培养时间6-12小时；

（4）发酵培养：

发酵培养基：豌豆蛋白废水，pH 6.5-7.5；

115℃灭菌30分钟，降温至38℃以下，接种种子罐液体菌种，接种量1%-3%（V/V）；

培养参数：温度37±1℃，搅拌转速150-250 rpm，通气量前10小时1：0.2-0.3,后期1：0.3-0.5,培养时间15-25小时，菌体浓度达到2.0×10⁹ CFU/mL以上。

3.用豌豆蛋白废水液体发酵生产纳豆枯草芽孢杆菌菌剂在生物肥料的应用。