[发明专利]提高大豆耐旱和抗除草剂性能的方法

权利要求书

1.含有目的基因的植物DNA重组双元表达载体，其特征是，分别在FvC5SD基因上游引入内切酶SpeI酶切位点，下游引入内切酶SacI酶切位点，通过双切双连的方法进行SpeI和SacI酶切后，连接至pYL质粒得到。

2.根据权利要求1所述含有目的基因的植物DNA重组双元表达载体，其特征是，所述FvC5SD来自香菇，序列全长891bp，其序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述植物DNA重组双元表达载体，其特征是，所述载体全长序列如SEQ ID NO:2所示。

4.权利要求1所述的含有目的基因的双元表达载体在提高植物抗除草剂性能方面的应用。

5.根据权利要求1所述的含有目的基因的双元表达载体在提高大豆抗除草剂性能方面的应用。

6.一种转基因工程菌株，特征在于，是由权利要求1所述的含有目的基因的植物DNA重组双元表达载体转入农杆菌EHA101中获得。

7.一种利用转基因技术提高大豆耐旱和抗除草剂性能的方法，其特征在于，所述方法为权利要求5所述的转基因工程菌株介导的大豆子叶遗传转化。

8.根据权利要求6所述的利用转基因技术提高大豆耐旱和抗除草剂性能的方法，特征在于，大豆受体品种为Williams82。

9.根据权利要求6所述的利用转基因技术提高大豆耐旱和抗除草剂性能的方法，其中获得抗除草剂性能的T₀代植株的步骤如下：

(1)农杆菌28℃培养16h后收集菌体，转入YEP液体培养基中，直至OD₆₀₀值0.5～0.7备用；

(2)选取大豆受体品种Williams82成熟种子，氯气灭菌16h，灭菌后种子放入GM萌发培养基(培养基配方参照OLHOFT等)弱光萌发16h；

(3)切子叶节，从胚轴处将大豆种子一分为二，切时刀尖蘸工程菌液，将切开后的子叶节放入工程菌液中，轻柔晃动30min，转入共培养基中，避光培养(23℃，3～5d)；

(4)共培养后，将伸长的胚轴切去约2/3，保留约5mm的胚轴，插入加筛选剂的SIM伸长培养基中，诱导丛生芽生长，培养条件25℃，光照16h/d，光照强度2000lx；

(5)在SIM培养基中培养7d后，转入SEM筛选培养基中，间隔15d继代1次，筛选3～4轮，得到分生苗；

(6)将已经伸长的分生苗从外置体上切下，转入生根培养基中生根；

(7)生根健全的转化苗，经炼苗(3～5d)后移入盆中栽培，获得TO代转基因植株。

10.根据权利要求6所述的利用转基因技术提高大豆耐旱和抗除草剂性能的方法，其特征是，获得抗除草剂和耐旱的大豆材料的方法如下：

(1)应用Bar试纸条检测、草胺膦除草剂涂抹、FvC5SD基因PCR扩增等方法对T₀代转化植株进行筛选鉴定，获得阳性植株；

(2)对阳性植株进行自交获得T₁代种子；

(3)培育T₁代大豆植株，对T₁代阳性植株进行PCR分子检测；

(4)通过PEG胁迫和土壤干旱对经PCR检测的阳性转基因大豆的T₁代株系的种子，进行大豆苗期耐旱性鉴定，得到转FvC5SD基因耐旱大豆材料。

11.根据权利要求9所述的利用转基因技术提高大豆耐旱和抗除草剂性能的方法，其特征是：

(1)所述PEG胁迫鉴定的方法为：将成熟饱满的籽粒分别放入浸种袋，用超纯水将种子清洗去掉浮灰，再用75％酒精消毒1分钟(浸泡)；用超纯水清洗2次；0.1％氯化汞灭菌10分钟；用超纯水清洗2次并去除表面水分；将受体材料和转基因材料籽粒放入直径9厘米玻璃培养皿中摆放整齐，以两层滤纸作为培养床；每个培养皿放10粒材料，以超纯水作为空白对照组，以-0.5Mpa的PEG6000胁迫为处理组，在人工气候培养室中进行培养，设置温度25℃，黑暗条件处理，湿度70％，培养时间为8天；我们从图5(上)中可以看出同样PEG条件下，转FvC5SD材料中发芽率高于对照CK；

(2)所述土壤干旱胁迫方法为：在PEG胁迫后发芽的转基因材料，用超纯水冲洗PEG溶液和用纸吸干根部水分，将苗移植到种植盆中，土壤含水量为15％左右(使苗能够移植存活)；在水分降低到1％(使用土壤含水仪测量)，保持土壤重度干旱胁迫7天，复水让土壤水分含量正常后，选择正常生长成活的转基因材料作为耐旱转基因材料。