[发明专利]牛传染性鼻气管炎病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒检测技术领域，具体涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis，IBR)又名牛疱疹病毒Ⅰ型感染症(Bovine herpesvirus type1infections，BoHV-1)是由牛传染性鼻气管炎病毒引起牛的一种急性接触性传染病，临床表现形式多样，以呼吸道为主，又称红鼻病或牛传染性坏死性鼻炎。自然条件下，仅牛对本病易感。病牛和带毒动物是主要传染源，隐性感染的种公牛精液带毒。病牛愈后可带毒6～12个月，甚至长达19个月。病毒主要存在于鼻、眼、阴道分泌物和排泄物中。急性BoHV-1呼吸道感染还可以继发其他细菌性或病毒性感染，造成牛呼吸道疾病综合征(BRDC)。

此病目前在世界范围内流行，对乳牛的产奶量、公牛的繁殖力及役用牛的使役力均有较大影响，结合流行病学，可做出初步诊断，但确诊必须依靠实验室诊断，实验室诊断包括病毒分离鉴定和血清学试验。通常检测血清样品中BoHV-1抗体的方法有病毒中和试验(VN)和各种酶联免疫吸附试验(ELISA)。另外，还有琼脂扩散试验和间接血凝试验。BoHV-1为DNA病毒，属疱疹病毒科，感染后一般发生病毒潜伏而长期带毒，适当应激条件下重新发病，使疾病在牛群中广泛流行。通常情况下鉴定血清学中阳性动物是检查动物感染状态非常有用而且理想的指标，抗体阳性动物可认为是病毒携带动物和潜在的排毒者，国内目前大型养牛场有使用牛传染性鼻气管炎疫苗，或者幼畜通过吸食初乳获得母源抗体，所以依靠血清抗体对疫病筛查需结合具体情况进行分析，最后的临床诊断仍是病原的检测。BoHV-1为双股DNA病毒，其病毒基因平均GC含量高于75％而有别与其它病毒，因其基因组特殊性限制了对BoHV-1的病原学快速检测方法的建立。鉴于目前临床仍缺乏适于临床现场应用的BoHV-1病原快速有效的检测方法，所以建立快速高效的检测方法对疫病得筛查为后期疫病得治疗和养牛业得健康发展尤为重要。

发明内容

为了解决现有检测牛传染性鼻气管炎病毒检测方法灵敏性低、血清学检测假阳性高、国外进口试剂昂贵的问题，本发明提供一种牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒，该试剂盒包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、无菌双蒸水、金纳米颗粒溶胶、一对特异性引物和一个牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3'，

P2：5'-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3'；

所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；

所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖。

作为优选的实施方式，所述含有306个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。

作为优选的实施方式，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。

本发明还提供了上述牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)配制PCR反应液

所述PCR反应液包括MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、无菌双蒸水、金纳米颗粒溶胶和一对特异性引物；

所述一对特异性引物分别为：鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物P1和P2：

P1：5'-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3'，

P2：5'-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3'；

(2)建立牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒

所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒；

所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；

(3)阴性对照：所述阴性对照为蒸馏水。