[发明专利]牛传染性鼻气管炎病毒nano‑PCR检测试剂盒及其制备方法在审
| 申请号： | 201710141706.3 | 申请日： | 2017-03-10 |
| 公开（公告）号： | CN107058620A | 公开（公告）日： | 2017-08-18 |
| 发明（设计）人： | 郭利;程世鹏 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院特产研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 长春菁华专利商标代理事务所(普通合伙)22210 | 代理人： | 于晓庆 |
| 地址： | 130112 吉林省*** | 国省代码： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 传染性 气管炎 病毒 nano pcr 检测 试剂盒 及其 制备 方法 | ||
1.牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、无菌双蒸水、金纳米颗粒溶胶、一对特异性引物和一个牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒；
所述一对特异性引物分别为：鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物P1和P2：
P1：5'-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3'，
P2：5'-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3'；
所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示；
所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖。
2.根据权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述含有306个碱基的核苷酸片段的序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为蒸馏水。
4.制备权利要求1至3中任意一项所述的牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制PCR反应液
所述PCR反应液包括MightyAmp酶、2xBufferMix缓冲液、无菌双蒸水、金纳米颗粒溶胶和一对特异性引物；
所述一对特异性引物分别为：鉴定牛传染性鼻气管炎病毒的引物P1和P2：
P1：5'-GCTCGCCAACTTCTTTCAGGG-3'，
P2：5'-GCGTCAAACTCCTCCTCTTCCTC-3'；
(2)建立牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒
所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒为含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒；
所述含有306个碱基的核苷酸片段构成的pMD18-T重组质粒能够在大肠杆菌DH5α感受态细胞中增殖；
(3)阴性对照：所述阴性对照为蒸馏水。
5.根据权利要求4所述的牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒通过以下方法制备：以牛传染性鼻气管炎病毒的gE基因为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到长度为306bp的扩增产物，将扩增产物回收并纯化后克隆至pMD18-T载体，得到牛传染性鼻气管炎病毒阳性对照质粒，其序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。
6.根据权利要求5所述的牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，以P1和P2为引物进行PCR扩增的反应条件：98℃2min；98℃10s，57℃5s，68℃1min，35个循环；68℃总延伸10min。
7.根据权利要求4所述的牛传染性鼻气管炎病毒nano-PCR检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述金纳米颗粒溶胶的直径为20nm，浓度为0.5μg/μL。
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