[发明专利]一种棉叶中萜烯类物质的测定方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种棉叶中萜烯类物质的测定方法，属于棉酚(G)及其相关物含量的测定方法技术领域。

背景技术

棉酚及相关物甲氧基半棉酚(DHG)、半棉酚(HGQ)、半棉酚(HG)、杀实夜蛾素(H_1-4)等是棉花中重要的抗虫性萜烯类次生物质，广泛存在于棉花各种组织器官中的色素腺体内。国内外对棉花抗虫萜烯类化合物种类和抗虫性能的研究表明，棉叶色素腺体内的棉酚等次生物质具有植物抗菌素的功能，可以使棉花抵御外界昆虫和微生物的侵害。棉酚在医药等领域都有重要的应用价值。

关于棉酚的测定方法很多，如薄层色谱法、紫外-可见分光光度法、核磁共振法(NMR)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相色谱-质谱检测法(HPLC-MS)。其中分光光度法应用较普遍，Smith-苯胺法利用棉酚中含有的芳香醛结构与苯胺反应形成黄色物质进行比色测定，而棉株中所有的含芳香醛基的物质均可与苯胺发生此反应，更不能将萜烯类物质分离。液相色谱分析方法，如国标法，适合于植物油或以棉籽饼为原料的食品中游离棉酚的测定。

由于现有技术的上述限制，目前还没有一种针对棉花样品的，在室温条件下，测定样品提取物的稳定性，简便、快速、可重复的测定棉叶中萜烯类物质的检测方法。

发明内容

因此，针对现有技术的上述问题，本发明提供一种简便、快速、可重复的测定棉叶中萜烯类物质的检测方法。

具体的，所述测定方法包括；

步骤一仪器试剂准备

准备液相色谱仪，DAD检测器，色谱柱，超声清洗器，振荡器，离心机；

准备棉酚标准品；

步骤二植株材料准备

采集棉叶样品；

步骤三棉酚标准品溶液的制备

称取棉酚标准品，用丙酮溶解，定容至容量瓶中，得到棉酚标准储备液，避光保存；

步骤四棉叶测试样品溶液的制备

称取粉碎样品于离心管中，加入提取溶剂，提取溶剂为体积比80∶20∶0.1的乙腈、水、磷酸，超声提取，提取液离心分离，经微孔滤膜过滤，获得棉叶则试样品溶液；

步骤五确定棉酚的峰

在相同的色谱条件下，将步骤四获得的棉叶测试样品溶液的HPLC(高效液相色谱法)图谱与棉酚标准品的HPLC图谱对比，确定棉酚的峰。

进一步的，所述步骤一中液相色谱仪为安捷伦1100型高效液相色谱仪，所述色谱柱为Eclipse Plus C₁₈柱，5μm，4.6×250mm，测试方法中所用有机试剂甲醇、丙酮、乙腈、磷酸均为色谱纯试剂，采用超纯水。

进一步的，所述步骤二中棉叶样品采集后，液氮研磨后真空干燥脱水处理。

进一步的，所述步骤三具体为，称取棉酚标准品50mg，用丙酮溶解，定容至50mL棕色容量瓶中，得到浓度为1000mg/L的棉酚标准储备液，4℃冰箱避光保存。

进一步的，所述步骤四具体为，称取粉碎样品100mg于离心管中，精确至0.0001g，加入2mL提取溶剂，提取溶剂为体积比80∶20∶0.1的乙腈、水、磷酸，超声提取15min，提取液离心分离，经0.45μm微孔滤膜过滤，获得棉叶测试样品溶液。

进一步的，所述步骤五中色谱条件为，HPLC法，流动相为甲醇：1％磷酸，V/V＝85∶15，等度洗脱；流速：1.0mL/min；检测波长：235nm；柱温：25℃；进样量20μL。

本发明的有益效果在于：本发明提供一种棉叶中萜烯类物质的测定方法，样品经过处理后，不需要浓缩及进一步的净化程序，采用高效液相色谱仪(HPLC)，对棉酚(G)及其相关物进行分离和含量的测定；在室温条件下，测定样品提取物的稳定性，精密度好，稳定性高，建立了一套简便、快速、可重复的检测方法，为棉花抗虫和育种工作者提供技术支持。

附图说明

图1为实施例中棉酚标准品的HPLC检测图谱；

图2为实施例中棉叶样品的HPLC检测图谱；

图3为实施例中棉酚标准品的标准工作曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式进行说明：

本实施例中，棉叶中萜烯类物质的测定方法的材料与方法如下：

仪器与试剂

安捷伦1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，色谱柱：Eclipse Plus C₁₈柱(5μm，4.6×250mm)，超声清洗器，振荡器，离心机。