[发明专利]一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋污染处理技术领域，特别涉及一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法。

背景技术

石油污染经常与石油工业事故，坦克及管道运输，石油储存罐泄露等有关，据统计每年至少有400000吨的原油泄露到海洋环境中。除了这些海事事故造成的石油泄露以外，海上油田的开发也是一个重要的污染源。随着全球经济的增长，全球贸易日趋激烈，海上运输也会越来越频繁，海上事故也将越来越多，海上石油污染必将愈演愈烈。利用生物的方法来修复石油污染环境近些年来越来越受关注，因为这种方法迅速、无残毒、低成本。

目前最常用的生物方法是人工培育和改良嗜油微生物，将这些微生物投入到污染的海洋环境中，进行石油烃类降解，以达到生物修复的目的。

微生物通过生产生物表面活性剂来降解石油，但是由于微生物底物价格高，下游加工工序成本昂贵，产量低等原因，将微生物用于工业化生产生物表面活性剂的范例较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，降解迅速、无残毒、成本低。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，

包括如下步骤：

(1)高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得：从舟山海域油泥污染区域取来油污泥样品，通过富集培养，筛选出具有乳化活性的菌株，对筛选出的具有乳化活性的菌株进行16S rDNA PCR，并对PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定，确定为铜绿假单胞菌；

(2)扩大培养：将步骤(1)获得的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150-180rpm，培养50-60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉；

(3)降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放步骤(2)获得的菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20-30克菌粉计，自然降解15-30天。

作为优选，高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得的具体步骤为：

A、取0.1g舟山海域的油污泥溶解于1L基础培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养3天后得液体菌种，取1mL液体菌种接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时获得菌液；

B、将菌液涂布到固体培养基上，30℃培养12h，随机挑选7个菌落分别接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时，收集菌液并提取细菌基因组DNA；

C、以提取的细菌基因组DNA为模板，分别进行16S rDNA PCR扩增，采用的引物为：正向引物为27F，反向引物为1492R，其中27F的5’端有FAM荧光标记；

D、将16S rDNA PCR产物使用HhaⅠ限制性内切酶进行酶切，37℃金属浴恒温过夜，酶切产物利用微型垂直PAGE凝胶电泳分离，最后通过荧光成像系统观察凝胶，各样本出现同样条带，确定为同一种菌；

E、对16S rDNA PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定确定为铜绿假单胞菌。

本发明通过RFLP的方法对优势菌进行检测和筛选，简单，成本低廉，高效快速，因此能够大大节约实验成本和时间，获得高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌。

作为优选，基础培养基配方为：Na₂HPO₄ 0.6g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，NaNO₃ 4.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，CaCl₂ 0.01g/L，FeSO₄ 0.01g/L，水余量。

作为优选，液体培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，Na₂HPO₄ 0.6g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，NaNO₃ 4.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，CaCl₂ 0.01g/L，FeSO₄ 0.01g/L，水余量。