[发明专利]一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法

权利要求书

1.一种利用高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌降解石油的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得：从舟山海域油泥污染区域取来油污泥样品，通过富集培养，筛选出具有乳化活性的菌株，对筛选出的具有乳化活性的菌株进行16S rDNA PCR，并对PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定，确定为铜绿假单胞菌；

(2)扩大培养：将步骤(1)获得的铜绿假单胞菌接种到液体培养基中培养，摇床培养条件为30±1℃，150-180rpm，培养50-60小时，离心，过滤，收集菌丝体，干燥后获得菌粉；

(3)降解石油：针对海洋石油污染，向石油污染海面投放步骤(2)获得的菌粉，菌粉投放量以处理每100克石油投放20-30克菌粉计，自然降解15-30天。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，高产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的获得的具体步骤为：

A、取0.1g舟山海域的油污泥溶解于1L基础培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养3天后得液体菌种，取1mL液体菌种接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时获得菌液；

B、将菌液涂布到固体培养基上，30℃培养12h，随机挑选7个菌落分别接种到1L液体培养基中，30℃、180rpm转速下摇床培养50小时，收集菌液并提取细菌基因组DNA；

C、以提取的细菌基因组DNA为模板，分别进行16S rDNA PCR扩增，采用的引物为：正向引物为27F，反向引物为1492R，其中27F的5’端有FAM荧光标记；

D、将16S rDNA PCR产物使用HhaⅠ限制性内切酶进行酶切，37℃金属浴恒温过夜，酶切产物利用微型垂直PAGE凝胶电泳分离，最后通过荧光成像系统观察凝胶，各样本出现同样条带，确定为同一种菌；

E、对16S rDNA PCR产物进行测序，并将测序结果与NCBI数据库进行比对，对菌株进行鉴定确定为铜绿假单胞菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，基础培养基配方为：Na₂HPO₄ 0.6g/L，KH₂PO₄0.2g/L，NaNO₃ 4.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，CaCl₂ 0.01g/L，FeSO₄ 0.01g/L，水余量。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，液体培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，Na₂HPO₄ 0.6g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，NaNO₃ 4.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，CaCl₂ 0.01g/L，FeSO₄0.01g/L，水余量。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，固体培养基配方为：葡萄糖20-40g/L，琼脂15g/L，Na₂HPO₄ 0.6g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，NaNO₃ 4.0g/L，MgSO₄ 0.3g/L，CaCl₂ 0.01g/L，FeSO₄0.01g/L，水余量。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，27F的核苷酸序列为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，M为A或C；1492R的核苷酸序列为：5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’，Y为C或T。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤C的PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，循环40次；最后72℃延伸10min。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤D中，微型垂直PAGE凝胶电泳的电泳缓冲液为TBE，电泳条件为100v恒压，2h。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤D中，微型垂直PAGE凝胶电泳的电泳凝胶配方为：蒸馏水5.5mL，30％Acr-Bis 25mL，1M的pH 8.8Tris 19mL，10％过硫酸铵0.5mL，TEMED 0.02mL。