[发明专利]一种旱柳枝条皮层叶绿体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，涉及的是一种旱柳枝条皮层绿色组织完整叶绿体的提取和纯化方法。

背景技术

木本植物枝条中的叶绿体能将线粒体呼吸释放和蒸腾流中扩散的CO₂回收固定，因绿色光合细胞主要位于皮层组织，因此将枝条中的叶绿体称为皮层叶绿体，枝条的光合作用称为皮层光合。皮层光合可将枝条中原本要释放到大气中的CO₂转化为碳水化合物，使植株在碳的利用上更加经济。皮层光合可减轻枝条中酸性物质对碱性细胞机构的伤害，减少无氧呼吸产生有毒物质，提高逆境下树木的生存竞争力。但皮层光合的运行机制仍不清楚，其成为近年来树木生理领域关注的焦点。叶绿体是行使光合作用的细胞器，皮层叶绿体的结构、功能是枝条皮层光合的基础。完整叶绿体的获得是开展叶绿体能量转化、电子传递、碳固定及下游组学研究的前提，但关于枝条皮层叶绿体的提取尚为空白，严重制约了皮层光合作用的生理和分子机制的研究。旱柳(Salix matsudana)是我国北方地区植被重建、生态修复的先锋树种，枝条皮层组织绿色光合细胞丰富，饱和光强下皮层光合可将枝条呼吸释放CO₂的80％回收，皮层光合速率高于其他常见北方树种。因此，以旱柳为材料，建立皮层叶绿体的提取纯化体系，将在细胞器、亚细胞器和分子水平上推动枝条皮层光合作用机制的研究。

目前，尚无关于旱柳皮层叶绿体制备方法的公开报道。该发明为旱柳枝条皮层叶绿体的制备提供了解决方案，一方面为其他木本植物枝条皮层叶绿体的提取奠定了基础，并为其他非叶光合器官叶绿体的获得提供了参考。

发明内容

本发明的目的在于建立旱柳枝条皮层叶绿体的提取、纯化体系，提供一种完整皮层叶绿体的制备方法，为开展皮层叶绿体光合生理与分子生物学的研究奠定基础。

本发明提供了一种旱柳皮层叶绿体的制备方法，包括如下步骤：

1)树皮采集；2)机械匀浆；3)纱布过滤；4)叶绿体粗沉淀制备；5)叶绿体粗沉淀悬浮；6)连续密度梯度液制备；7)等密度离心；8)完整叶绿体回收。以上步骤均要求在4℃低温下进行。

所述1)树皮采集，是指在生长季清晨从当年生枝条上拨下树皮(木质部外侧的组织，包括表皮、周皮、皮层、韧皮部)，在周皮栓内层和韧皮部射线中存在少量光合细胞，但与皮层组织中的绿色光合细胞相比，数量微乎其微，因此树皮可作为皮层叶绿体提取的供试材料。

所述2)机械匀浆，是指将树皮块置于匀浆机中，按照1:10的重量体积比(重量单位为g；体积单位为ml)加入分离液，匀浆使叶绿体从皮层组织中游离。

所述3)纱布过滤，是指将匀浆液经4层纱布过滤，去除匀浆后残留的组织残渣。

所述4)叶绿体粗沉淀制备，是指将收集的滤液分装在离心管中，先在低离心力下离心，使沉降系数较大的细胞壁和细胞核沉淀，然后取上清液，提高离心力，获得叶绿体粗沉淀。

所述5)叶绿体粗沉淀悬浮，是指在每管叶绿体粗沉淀中加入适量悬浮液，充分悬浮，避免叶绿体颗粒间的聚集粘附。

所述6)连续密度梯度液制备，是指将等渗的40％Percoll置于角转子中离心，使其形成连续的密度梯度。

所述7)等密度离心，是指取叶绿体粗沉淀悬浮液，在连续密度梯度液的上方铺层，置于甩开转子中离心，使破碎叶绿体与完整叶绿体分层。

所述8)完整叶绿体回收，是用注射器抽取等密度离心后得到的完整叶绿体条带，用悬浮液稀释后离心，得到完整叶绿体沉淀。

本发明的创新之处是公开了一种基于预形成梯度等密度离心的旱柳枝条皮层叶绿体的制备方法。目前，国内外未见同类报道。

本发明可保证叶绿体的纯度、完整度符合下游光合生理和分子生物学实验的要求，并为非叶光合器官叶绿体的分离提供了一种新的思路。

附图说明

图1是本发明所述等密度离心前的铺层和离心后的叶绿体分层情况；

图2是本发明得到的叶绿体的显微镜检情况；

图3是本发明得到的叶绿体的完整性检验情况。

具体实施方式

下面将结合具体的实施例对本发明进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。

实施例1以本发明的方法制备旱柳枝条皮层叶绿体