[发明专利]提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法及改造菌

说明书

本发明公开了提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α‑酮异戊酸的方法及改造菌。所述方法为：失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶，或者还同时失活吲哚‑3‑丙酮酸脱羧酶和/或乳酸脱氢酶。该方法中酶失活后的克雷伯氏肺炎杆菌为改造菌。将改造的克雷伯氏肺炎杆菌接种到碳源培养基中进行发酵培养，发酵过程中改造的克雷伯氏肺炎杆菌将培养基中的碳源转化成α‑酮异戊酸。本发明提供的提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α‑酮异戊酸的方法，改造的菌株中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸。

背景技术

α-酮异戊酸又称为2-酮基异戊酸、酮缬氨酸。是一种α-酮酸，α-酮酸不稳定，容易脱羧，导致自然界天然存在的α-酮酸很少。在生物体内，α-酮酸一般仅以中间体的形式存在，作为生物体内多种物质的前体。α-酮异戊酸是一种重要的细胞中间代谢产物。α-酮异戊酸是L-缬氨酸，L-亮氨酸和泛酸合成的前体，现在作为慢性肾脏疾病患者服用L-缬氨酸，L-亮氨酸的替代品。利用α-酮异戊酸作为原料，利用L-缬氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶催化反应，可以还原氨基化合成L-缬氨酸(Appl Microbiol Biotechnol,1990,34:236-241)。

α-酮异戊酸主要通过化学合成方法进行生产，包括海因法、草酸法等。将海因水溶液与丙酮混合，滴加乙醇胺，通过回流反应可以合成异亚丙基海因。异亚丙基海因在氢氧化钠溶液中回流再用硫酸调节pH到酸性可以获得α-酮异戊酸钠盐(化工时刊，2007,12:5-8)。将草酸二乙酯加入甲醇钠溶液反应，再加入异丁醛反应，再加入氢氧化钠溶液反应后，加入盐酸反应。反应产物经过萃取后加入氢氧化钠，再加入氯化钙，可以合成α-酮异戊酸钠盐(中国专利201210171694)

目前未见野生微生物合成α-酮异戊酸的公开报道。谷氨酸棒杆菌中敲除aceE基因，aceE是丙酮酸脱氢酶复合物中一个亚基的编码基因，敲除转氨酶基因ilvE，同时表达ilvBNCD基因，再敲除丙酮酸：醌氧化还原酶基因pqo构建工程菌株，该工程菌株可以21.8g/L的α-酮异戊酸(Applied And Environmental Microbiology,2010,8053–8061)。

克雷伯氏肺炎杆菌是一种重要的工业微生物，具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。目前克雷伯氏肺炎杆菌用于1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、2-酮基葡萄糖酸、乙偶姻等生产菌株，具有底物转化率高和产物终浓度高等优点。未发现关于克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的公开报道。

发明内容

本发明的目的是，提供改造的克雷伯氏肺炎杆菌及其应用于生产α-酮异戊酸的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

提升克雷伯氏肺炎杆菌生产α-酮异戊酸的方法，该方法为：失活克雷伯氏肺炎杆菌中的乙酰乳酸脱羧酶，或者还同时失活吲哚-3-丙酮酸脱羧酶和/或乳酸脱氢酶。

本发明还提供改造的克雷伯氏肺炎杆菌，该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌；或者该改造的克雷伯氏肺炎杆菌为乙酰乳酸脱羧酶和乳酸脱氢酶和吲哚-3-丙酮酸脱羧酶同时失活的克雷伯氏肺炎杆菌。