[发明专利]体外诱导人的多能干细胞分化为精原干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学、分子生物学和医学领域的研究领域，涉及一种体外诱导人的多能干细胞(包括人的胚胎干细胞，hESCs，和人的诱导型的多能干细胞，hiPSCs)分化为精原干细胞的方法，更具体地说，还涉及多能干细胞分化为精原干细胞及其在生殖中的研究及其应用。

背景技术

人的精原干细胞(human Spermatogonial Stem Cells，hSSCs)在男人的一生中能够一直启动和维持男性生精的能力。然而，对于hSSCs的生物学特性及细胞内如何控制hSSCs的自我更新与分化的机制还不太清楚。这主要是由于从人的睾丸组织中获取hSSCs，存在来源稀少的实际困难和伦理学的问题。而众所周知，人的多能干细胞(包括hESCs和hiPSCs)能分化为所有类型的细胞，包括生殖细胞，那样就为基础研究和临床细胞治疗提供来无限的和充足的细胞来源。另外一方面，在最近几年来，许多未成年而患上了癌症的男孩，经过高剂量的放化疗的治疗后，能够长期生存下来的人数不断增加，但是一旦他们发育成年，却要面对癌症治疗的副作用——不孕。而在将来，可能通过自体的hSSCs或自体体细胞重编程建立的iPSCs分化为hSSCs再移植到睾丸中，然后hSSCs在体内分化产生精子，这样可能解决这个问题。但也面临着一个严峻的问题：没有足够多的hSSCs用于移植。基于以上背景，本发明探索了一种方法，将人的多能干细胞分化为hSSCs，这样可以获得足量的hSSCs用于基础研究。另外，一方面，对于患上癌症的未成年人，将来也可以通过自体体细胞重编程建立的iPSCs分化为hSSCs，再移植到睾丸中在睾丸产生精子，这样可能解决不孕的问题。所以，将人的多能干细胞体外诱导分化为hSSCs，再进行体外扩增培养，将来可以用于基础和临床研究。。

发明内容

本发明的目的是提供一种人的多能干细胞体外诱导分化为精原干细胞的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种体外诱导人的多能干细胞分化为精原干细胞的方法，其特征在于，包括：

步骤1：首先将人的多能干细胞培养在饲养层细胞上或在TeSR培养基中培养1-2天，然后在第一分化培养基中继续培养8-15天，其中，前面4-6天在37℃，5％CO₂浓度下，饱和湿度培养箱中培养，然后移到34℃，5％CO₂浓度下，饱和湿度培养箱中培养2-11天；

步骤2：将步骤1所得的细胞转到第二培养基中，34℃，5％CO₂浓度下，饱和湿度培养箱中培养4-8天；

步骤3：将步骤2中的第二分化培养基换成第三分化培养基，细胞继续在34℃，5％CO₂浓度下，饱和湿度培养箱中培养4-8-天。

优选地，所述的第一分化培养基包括基础培养基a-MEM，0.88μM硬脂酸(stearic acid)，60μM腐胺(putrescine)，2.36μM棕榈酸(palmitic acid)，0.21μM棕榈油酸(palmitoleic acid)，2.71μM亚油酸(Linoleic acid)，1.02μM油酸(oleicacid)和0.43μM亚油酸(linolemic acid)。

更优选地，所述的第一分化培养基还包括10μg/ml转铁蛋白(transferrin)，10mMHepes，2mM L-谷氨酰胺(L-glutamine)，50mM β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，0.2％牛血清白蛋白(BSA)，5μg/ml胰岛素(insulin)。

更优选地，所述的第一分化培养基还包括20ng/ml重组人的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和1ng/ml重组人的碱性成纤维生长因子(bFGF)。

优选地，所述的第二分化培养基包括advanced DMEM-F12基础培养基，2％胎牛血清(FBS)，5ng/ml GDNF，2μM全反式维甲酸(retinoic acid，RA)，和50ng/ml干细胞因子(SCF)。

优选地，所述的第三分化培养基包括advanced DMEM-F12基础培养基，4ng/ml GDNF，0.1μg/ml睾酮(testosterone，TTE)，8μg/ml维生素C(Vc)3U/ml维生素A(VA)，0.2g/ml维生素E(VE)和0.1U/ml重组人的卵泡刺激素(rhFSH)。

优选地，所述的饲养层细胞可通过小鼠的胚胎经分离培养得到。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：