[发明专利]一种重组腺病毒载体及其构建方法和用途

说明书

本发明提供了一种重组腺病毒载体及其构建方法，其特点是能很好的避免针对Ad5载体本身的预存免疫，即该载体的免疫原性几乎不受人体内广泛存在的Ad5中和抗体干扰。本发明的实现是基于以人体稀有血清型腺病毒Ad35的抗原决定簇基因替换Ad5的相应部分。而用于替换的稀有血清型腺病毒以及替换基因的选择是基于有利于改造后病毒载体的包装和不影响原病毒载体免疫水平考虑的。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于基因治疗和疫苗载体的重组腺病毒载体及其构建方法。

背景技术

腺病毒 （adenovirus, Ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初，当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猴类病毒 40（SV40）基因组杂交，说明腺病毒基因组可承载异源性基因。此后腺病毒逐步发展成一种重要的载体系统。

目前，已经鉴别了57种不同的腺病毒血清型，重组腺病毒载体在基因治疗和疫苗载体方面得到了很多的应用，尤其是人血清5型腺病毒，它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒（HIV）疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。

然而，由于人体内普遍存在抗Ad5腺病毒本身的免疫反应，这种预存的免疫反应包括抗腺病毒中和抗体和针对腺病毒的杀伤性T细胞，从而抑制其进入机体细胞而其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的CTL反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。总之，预存免疫反应会大大降低基于腺病毒载体的疫苗免疫或者基因治疗的效果。

为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，研究者们尝试了多种方法：（1）利用新方法运载重组Ad5载体；（2）从其它人体腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体；（3）对Ad5载体进行基因工程改造，这一方法与其他方法相比更安全也更具有应用性。该方法具体是以源于人体安全性较好的人体稀有血清型腺病毒如Ad35、Ad48以及Ad49等的抗原决定簇基因替换Ad5载体的相应基因以期获得既保留Ad5载体的免疫原性，又带有稀有腺病毒亚型血清学性质的嵌合载体。专利CN104419717A公开了一种构建重组腺病毒的方法，所述方法包括以其他人腺病毒血清型的 HVR5、7 替换 RAd5 载体的 HVR5、7，其中所述其他人腺病毒血清型是 Ad43 或 Ad37，但该方法存在如下缺陷：（1）其只是替换HVR，不能完全逃避预存免疫；（2）在制备中使用了至少四个不同公司的载体，价格昂贵，操作不便。

因此，目前在该领域仍然需要通过基因工程技术进一步改造腺病毒载体以获得一种操作简便、易于包装、免疫水平较高且能很好的避免预存的重组腺病毒载体。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种重组腺病毒载体及其构建方法，该重组腺病毒载体能很好的避免针对Ad5载体本身的预存免疫，同时既保留Ad5载体的强免疫原性，又带有稀有血清型腺病毒血清学性质，且操作简便。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种重组腺病毒载体，其是采用分子克隆的方法，将Ad5载体的骨架质粒中的整个六邻体（hexon）用人稀有腺病毒血清型Ad35的六邻体替换，得到重组腺病毒载体RAd5-35-Hexon-Adbone。

本发明还提供一种重组腺病毒载体的构建方法，包括如下步骤：

（一）中间载体改造，在Puc19载体的限制性酶切位点XbaI和BamHI间引入AscI和NruI，获得中间载体Puc19-AscI-NruI；

（二）将原始Ad5骨架质粒用AscI进行单酶切，回收9620bp的片段，同时用AscI单酶切上述Puc19-AscI-NruI，回收2680bp的片段，将上述回收的两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-AscI;