[发明专利]一种重组腺病毒载体及其构建方法和用途

权利要求书

1.一种重组腺病毒载体，其特征在于，其是采用分子克隆的方法，将5型腺病毒rAd5载体的骨架质粒中的六邻体用人稀有腺病毒血清型Ad35的六邻体替换，得到重组腺病毒载体rAd5-35-Hexon-Adbone；所述分子克隆的方法包括如下步骤：

（一）改造Puc19载体：在Puc19载体的限制性酶切位点XbaI和BamHI间引入AscI和NruI，获得中间载体Puc19-AscI-NruI；

（二）将原始Ad5骨架质粒用AscI进行单酶切，回收9620bp的片段，同时用AscI单酶切上述中间载体Puc19-AscI-NruI，回收2680bp的片段，将上述回收的两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-AscI；

（三）质粒9620-Puc19-AscI用HindIII单酶切，回收7000bp的片段，同时用HindIII单酶切载体Puc19，回收2680bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒7000-Puc19-HindIII；

（四）基于质粒7000-Puc19-HindIII，在Ad5骨架质粒的六邻体 5’端插入酶切位点ClaI，PCR扩增该六邻体 5’端A和B两段，在片段A和B连接处插入单酶切位点ClaI，引物设计如下：

片段A

上游：5’-TCTAGACTGGTGACGCAAATAGACGA-3’

下游：5’-TCTATCGATGGGGTAGCCATAAGCTT-3’

片段B

上游：5’-TCTAGACCCATCGATGATGCCGCA-3’

下游：5’-CTTGCTCGTCTACTTCGTCTAAGCTT-3’；

（五）将片段A连接至Puc19载体，用ClaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A，回收3100bp的片段；将片段B连接至Puc19载体，用ClaI和HindIII双酶切质粒Puc19-B，回收500bp的片段；将回收的两部分片段连接，构建质粒Puc19-A+B；

（六）用XbaI和HindIII双酶切质粒Puc19-A+B，回收1000bp的片段，同时用DraIII-HF和RsrII双酶切质粒7000-Puc19-HindIII，回收9800bp的片段，将回收的两部分片段用快速重组克隆试剂盒连接，即构建质粒7000-Puc19-ClaI；

（七）PCR扩增Ad35hexon，引物设计如下：

上游：5’-ATGGCCACCCCATCGATGCTGCC-3’

下游：5’-TACGTGGTAGCGTTGCCGGCCGAGA-3’

回收Ad35hexon的2800bp片段；

（八）ClaI和NaeI双酶切质粒7000-Puc19-ClaI，回收7000bp的片段，同时ClaI和NaeI双酶切PCR回收的Ad35hexon，回收2800bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒7000-Puc19-Ad35；

（九）HindIII单酶切7000-Puc19-Ad35，回收7000bp的片段，同时用HindIII单酶切质粒9620-Puc19-AscI，回收5400bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒9620-Puc19-Ad35；

（十）AscI单酶切原始Ad5骨架质粒，回收25000bp的片段，同时用AscI单酶切质粒9620-Puc19-Ad35，回收9620bp的片段，将回收的两部分片段连接，构建质粒Ad5-35-Hexon-Adbone；

其中，所述原始Ad5骨架质粒为pBHGlox(delta)E1,3Cre。

2.如权利要求 1所述的重组腺病毒载体在制备疫苗或基因治疗药物的用途。