[发明专利]一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法

权利要求书

1.一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采集太湖流域共11个采样点的水样；

(2)将步骤(1)中的11个水样分别用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤并分别收集过滤出的微生物样品，待滤膜完全堵住为止；

(3)对步骤(2)中过滤出的11个微生物样品分别进行DNA的提取；

(4)对步骤(3)中提取的DNA样品利用超微量蛋白质核酸分析仪测定其浓度和纯度，并将DNA样品保存于-20℃下；

(5)对步骤(4)中的DNA样品进行16S rDNA的普通PCR扩增，以及实时荧光定量PCR定量分析；

(6)对步骤(4)中的DNA样品进行16S rRNA基因的PCR扩增，对得到的扩增产物进行纯化，得到PCR纯化产物；

(7)对步骤(6)中的PCR纯化产物进行Miseq高通量测序，测序结果进行数据的降噪处理后，在处理平台上进行系统分类，对太湖水体中浮游细菌进行微生物群落解析。

2.如权利要求1所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：在步骤(5)中，所用的引物序列(5’-3’)为：

正向引物CGAATATGGAATCCCTAGTAACT，

反向引物GCCCACTCAGTTCGATACGC。

3.如权利要求2所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：步骤(5)中，16S rDNA的PCR扩增反应体系为25μL，反应程序为：94℃预变性5min后，95℃变性15s，退火温度58℃下反应30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃下延伸7min。

4.如权利要求3所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：步骤(5)中，在对16S rDNA进行实时荧光定量PCR(qPCR)时，预变性95℃下热变性15min；然后进入45个循环的扩增阶段，包括95℃变性15s，退火温度57.5℃下反应30s，72℃延伸30s；溶解曲线温度为60℃至95℃之间。

5.如权利要求1所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：在做高通量测序前，步骤(6)中，对16S rRNA基因进行PCR扩增时，优选地，所述的引物为序列(5’-3’)为：

正向引物AGAGTTTGATYMTGGCTCAG，

反向引物TGCTGCCTCCCGTAGGAGT。

6.如权利要求5所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：步骤(6)中，16S rRNA基因PCR扩增体系为50μL，PCR扩增过程为：98℃预变性5min后，98℃变性30s，退火温度50℃下反应30s，72℃延伸40s，共20个循环，最后72℃下延伸10min。

7.如权利要求2所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：步骤(6)中，将PCR扩增后的平行样混合，用E.Z.N.A.Cylcle-Pure试剂盒(Omega Bio-tec Inc.,USA)进行纯化。

8.如权利要求7所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：步骤(6)中，将PCR纯化产物利用Illumina的第二代高通量测序平台Miseq进行测序分析。

9.如权利要求8所述的太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，其特征在于：步骤(7)中，测序结果使用Sickle和Mothur程序进行降噪处理后，以条序列最少的样品为基准，使用Mothur软件的“Sub.sample”命令从其他样品中随机抽取相同的条序列，进行测序深度的统一；每个样品在相同的测序深度下在Ribosomal Database Project Classifier处理平台上进行系统分类，得出所有细菌的解析结果。