[发明专利]一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，利用成组生物学技术对太湖水体中浮游细菌群落进行评价，属于微生物分析技术领域。

背景技术

蓝藻水华爆发是湖泊富营养化的重要表征之一，能够引发一系列的环境和生态问题。蓝藻水华聚集会导致水面覆盖，使得水生植物难以进行有效的光合作用，导致水体局部缺氧，造成鱼类等水生生物大量死亡，严重时可能引发“湖泛”；另外蓝藻水华衰亡过程中，会释放大量微囊藻毒素，危害人体及水体生态系统安全；蓝藻水华衰亡还会引发恶臭，在观感和嗅觉上对人体和环境造成不良影响。由于我国近半数以上的湖泊已处于富营养化状态，蓝藻水华频频发生，已引起各级政府的高度重视。

目前，针对蓝藻水华的产生机理，国内外学者已开展了大量研究，多种理论及技术手段得以充分应用。但受条件限制，现有成果多集中在宏观领域，而对蓝藻的组织结构、生长形式、与环境因子的相关性等微观领域的研究较少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为了更加系统地解析太湖水体中微生物的群落结构，本发明提供一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，利用成组生物学技术对太湖水体中浮游细菌群落进行评价。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种太湖水体中浮游细菌群落的评价方法，包括以下步骤：

(1)采集太湖流域共11个采样点的水样；

(2)将步骤(1)中的11个水样分别用0.45μm的混合纤维素滤膜过滤并分别收集过滤出的微生物样品，待滤膜完全堵住为止；

(3)对步骤(2)中过滤出的11个微生物样品分别进行DNA的提取；

(4)对步骤(3)中提取的DNA样品利用超微量蛋白质核酸分析仪测定其浓度和纯度，并将DNA样品保存于-20℃下；

(5)对步骤(4)中的DNA样品进行16S rDNA的普通PCR扩增，以及实时荧光定量PCR定量分析；

(6)对步骤(4)中的DNA样品进行16S rRNA基因的PCR扩增，对得到的扩增产物进行纯化，得到PCR纯化产物；

(7)对步骤(6)中的PCR纯化产物进行Miseq高通量测序，测序结果进行数据的降噪处理后，在处理平台上进行系统分类，对太湖水体中浮游细菌进行微生物群落解析。

进一步地，在上述方案中，在步骤(5)中，所用的引物序列(5’-3’)为：

正向引物CGAATATGGAATCCCTAGTAACT，

反向引物GCCCACTCAGTTCGATACGC。

进一步地，在上述方案中，步骤(5)中，16S rDNA的PCR扩增反应体系为25μL，反应程序为：94℃预变性5min后，95℃变性15s，退火温度58℃下反应30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃下延伸7min。

进一步地，在上述方案中，步骤(5)中，在对16S rDNA进行实时荧光定量PCR(qPCR)时，预变性95℃下热变性15min；然后进入45个循环的扩增阶段，包括95℃变性15s，退火温度57.5℃下反应30s，72℃延伸30s；溶解曲线温度为60℃至95℃之间。

进一步地，在上述方案中，在做高通量测序前，步骤(6)中，对16S rRNA基因进行PCR扩增时，所选的引物为序列(5’-3’)为：

正向引物AGAGTTTGATYMTGGCTCAG，

反向引物TGCTGCCTCCCGTAGGAGT。

进一步地，在上述方案中，步骤(6)中，16S rRNA基因PCR扩增体系为50μL，PCR扩增过程为：98℃预变性5min后，98℃变性30s，退火温度50℃下反应30s，72℃延伸40s，共20个循环，最后72℃下延伸10min。

进一步地，在上述方案中，步骤(6)中，将PCR扩增后的平行样混合，用E.Z.N.A.Cylcle-Pure试剂盒(Omega Bio-tec Inc.,USA)进行纯化。

进一步地，在上述方案中，步骤(6)中，将PCR纯化产物利用Illumina的第二代高通量测序平台Miseq进行测序分析。

进一步地，在上述方案中，步骤(7)中，测序结果使用Sickle和Mothur程序进行降噪处理后，以条序列最少的样品为基准，使用Mothur软件的“Sub.sample”命令从其他样品中随机抽取相同的条序列，进行测序深度的统一；每个样品在相同的测序深度下在Ribosomal Database Project Classifier处理平台上进行系统分类，得出所有细菌的解析结果。