[发明专利]二肽肽酶I体外微量快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及到血液二肽肽酶I活性表达的体外快速检测方法

背景技术

二肽肽酶I(dipeptidyl peptidase,DPPI)是溶酶体内一种半胱氨酸蛋白酶，又称组织蛋白酶C)，具有肽链外切酶的活性，高表达于人体免疫系统颗粒免疫细胞，包括肥大细胞、中性粒细胞和粘膜T细胞，是丝氨酸炎症蛋白酶原的专属激活酶。在炎症、细胞外基质重构和组织微环境的稳态维持起到重要作用。DPPI血液中的表达和活性和一些特定的病理生理状态相关，所以DPPI检测方法的建立，无论是实验室还是医院临床都有着重要意义。

现有的测定DPPI的方法为ELISA法或者WESTEN BLOTTING法，耗时长且耗资高，而结果只能说明样品中有或无DPPI蛋白质的存在但无法表明DPPI酶活性功能的存在和变化。我们前期发明的荧光仪高通量方法检测血清中DPPI的活性已经能够表明样品中DPPI酶活性的存在和变化，但问题一是制备血清过程长，病人血的用量大；二是实验仪器昂贵，属于大型分析仪器，保养维护昂贵复杂；三是单个样品检测成本较高，不能实现现场检测。所以，建立简单易行耗时耗资少的DPPI活性表达的检测的方法对与免疫颗粒细胞相关的疾病研究和DPPI的活性检测，包括类风湿疾病的早期诊断都有着重要的意义。

本发明的反应原理是：DPPI与其专属性底物相互作用后释放自由的三氟甲基香豆素产物，而自由的三氟甲基香豆素产物产生荧光，在紫外灯下可见。本发明是基于我们自己前期使用大型荧光仪器设备的研究结果，进一步转化为纸层析系统的快速检测手段。本发明不但改善了上述使用荧光仪器设备高通量方法的三个问题，并建立了一个体外快速检测的新方法。本发明用XYZ1601纸层析的方法检测血液中DPPI的活性表达水平，特点是鲜血微量(0.5-1微升)，无需血清制备，分析耗时短，易操作，可用于现场测定。

本发明使用了human recombinant DPPI(hrDPPI)作为预测试对象首先建立测定系统，然后用hrDPPI作为系统阳性对照，测定人血液或大鼠中的DPPI活性表达水平，同时用荧光仪测定作为纸层析的结果确认。

研究表明，类风湿疾病的发生和发展和免疫颗粒细胞的激活相关(Eklund KK.Mast cells in the pathogenesis of rheumatic diseases and as potential targets for anti-rheumatic therapy.Immunological Reviews.2007,217(1):38-52.和Wright H L.The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis[J].Nature Reviews Rheumatology,2014,10(10):593-601.)，DPPI来源于颗粒细胞，包括肥大细胞，中性粒细胞，粘膜T淋巴细胞，并和这类细胞的激活有关，所以，DPPI的检测代表了体内免疫系统中颗粒细胞的激活。我们前期的研究(X.Zhou,et al.,Serum based fluorescent assay for evaluating dipeptidyl peptidase I activity in collagen inducedarthritis rat model,Molecular and Cellular Probes(2016),http://dx.doi.org/10.1016/j.mcp.2016.10.009和X.Zhou,et al.Activation of mast cells and their subsets in the synovium in osteoarthritis(OA)and rheumatoid arthritis(RA).Journal of Allergy and Clinical Immunology.2010；125(2),S178.)也表明了DPPI与类风湿关节炎的炎症发展有关。本研究将本发明的检测方法应用在类风湿的大鼠模型中，以进一步确认本发明的准确性。