[发明专利]一种基因工程菌及其在制备莱鲍迪甙A中的应用

说明书

本发明公开了一种基因工程菌及其在制备莱鲍迪甙A中的应用，首先构建得到产甜叶菊糖基转移酶UGT76G1和UDP‑葡萄糖焦磷酸化酶UGPase的基因工程菌，它是在组成型表达甜叶菊糖基转移酶UGT的重组菌基础上，过表达UDP‑葡萄糖焦磷酸化酶UGPase，增加糖基化反应的糖基供体量。然后建立全细胞催化反应体系，将甜菊甙转化为莱鲍迪甙A。菌用量浓度为1~10g/L；葡萄糖用量20~120g/L；底物甜菊糖甙的用量为1~20g/L，催化反应过程中，对细胞催化剂进行表面活性剂处理，增加了细胞通透性，大幅提高了莱鲍迪甙A的产量。本发明利用胞内UDPG的合成途径，提高胞内UDPG糖基共体量，避免其额外添加、实现再生循环，酵母的培养和重组酶的表达同时进行，缩短了重组菌培养及重组酶表达的周期。

技术领域

本发明涉及一种产甜叶菊糖基转移酶UGT76G1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UGPase的基因工程菌及其在制备莱鲍迪甙A中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

甜菊糖是一种从甜味菊茎叶中提取的天然甜味剂，其主要成分为甜菊糖甙，它是一种高甜度、低热值的非发酵性的天然甜味剂。甜度约为蔗糖的200～300倍，其中提纯的莱鲍迪甙A糖的甜度约为蔗糖的450倍，味感更佳。甜菊糖的热值仅为蔗糖的1/300[1],与蔗糖、葡萄糖等天然甜味剂，甜密素、阿斯巴甜等化学合成甜味剂相比，甜菊糖具有热量低、甜度高、味质好、耐高温、稳定性好等特点，摄入人体后不被吸收,不产生热量[2],是糖尿病和肥胖病患者适用的甜味剂。对人体安全无毒，而且还兼有促进代谢、治疗胃酸的作用，对肥胖症、糖尿病、动脉硬化等有辅助疗效[3,4,5]。由于甜菊糖苷属非发酵性物质，具有耐热、稳定、防腐等性能，所以加到食品饮料中不易变性、变质。此外，它对酸碱度的要求不高，保存时间长，不易结块、褐变。因此，可以被广泛应用于食品领域。甜菊糖是目前世界已发现并经我国卫生部、轻工业部批准使用的最接近蔗糖口味的天然低热值甜味剂[6]。是继甘蔗甜菜糖之外第三种有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际誉为“世界第三蔗糖”。

甜菊叶中三种最主要的糖苷成分在叶片中的含量通常为：甜菊苷（Stevioside，St甙）占叶片干重9.1%，莱鲍迪甙A（Rebaudioside A,RA甙)占3.8%，莱鲍迪苷C占0.6%[7]。近年来，包括以上三种糖苷组分在内，研发人员已从甜叶菊中分离得到11 种糖苷。其中RA甙与其它糖苷相比，其甜度高，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，甘苦味和甘草异味低，稳定性好，是一种理想的天然高倍甜味剂产品。因此，提高甜菊糖甙的含量，尤其是提高RA 甙的纯度，获得高品质的甜菊糖，成为甜菊糖产业升级和产品改进的重要目标和内容。

采用分离提纯工艺来分离RA甙与St甙生产RA甙，其中HPLC法分离RA 甙和St甙的效果最好，但其处理量太小，难以放大化后用于工业化生产；重结晶法工艺繁复，能量消耗大，时间周期长，且存在有机溶剂残留等问题；树脂吸附虽然吸附和交换容量大，容易规模化生产，但莱鲍迪甙A(RA甙) 与含量高的甜菊甙(St甙) 在化学结构和极性上非常相近，造成对RA 甙的吸附选择性比较小，影响分离效果，使得莱鲍迪甙A得率低，在工业实际应用中存在一定的困难。目前生物酶法合成RA甙的方法需要外加昂贵的UDP-葡萄糖为底物，通过UDP-葡萄糖基转移酶的作用，催化St甙生成RA甙，致使酶催化St甙合成RA甙的经济性较差、缺乏市场竞争力。

参考文献

[1]陈慕英，于喜水孙玉华，等.中医药信息[J].2001,18(3):23.

[2] CarakoStas MC，Curry LL，Boileau AC，et al．Overview: the hiStory，technical function and safety of rebaudioside A，a naturally occurring Steviolglycoside，for use in food and beverages[J]．Food Chem Toxicol，2008，46(7):1-10．