[发明专利]一种基因工程菌及其在制备莱鲍迪甙A中的应用

权利要求书

1.一种产甜叶菊糖基转移酶UGT76G1和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UGPase的基因工程菌，其特征在于，它是将UGT76G1和UGPase编码基因插入到含有两个强启动子PGK1 和TEF1的组成型酿酒酵母穿梭质粒pESC-LEUD中，并将重组质粒导入表达宿主酿酒酵母Saccharomycescerevisiae YPH499中得到的工程菌；UGT76G1编码基因插入载体的酶切位点为SalⅠ和XhoⅠ；UGPase编码基因插入载体的酶切位点为SpeI和Sac I；

其中，所述的UGT76G1编码基因为GenBank，No.GenBank:AY345974.1，该基因序列命名为UGT；所述的UGPase编码基因为GenBank，Gene ID: 853830，该基因序列命名为UGPase；

所述工程菌利用胞内UDPG的合成途径，提高胞内UDPG糖基共体量，避免其额外添加、实现再生循环，实现莱鲍迪甙A合成量的增加；采用该工程菌进行全细胞催化反应，以混合糖甙为底物，反应后莱鲍迪甙A含量从10%提高到63%以上。

2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ双酶切UGT基因片段和pESCD载体，连接UGT基因片段纯化产物与pESCD载体，得到重组质粒pESCD-UGT；

2）用限制性内切酶SpeⅠ和SacⅠ双酶切UGPase基因片段和pESCD-UGT载体，连接UGPase基因片段纯化产物与pESCD-UGT载体，得到重组质粒pESCD-UGT-UGPase；

3）将鉴定后的阳性克隆的质粒导入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YPH499中，得到基因工程菌YPH499- pESCD-UGT-UGPase。

3.权利要求1所述的基因工程菌的诱导表达方法，其特征在于，挑取重组工程菌的单菌落到SC-L培养基中，30℃振荡培养过夜，然后按1~5%接种量接种到碳源为葡萄糖的培养基上，培养时间为16~28h 。

4.权利要求1所述的基因工程菌在生产莱鲍迪甙A中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用全细胞催化法，以组成型表达UGT和UGPase的基因工程菌为全细胞催化剂，加入细胞通透剂改变细胞的通透性，以甜菊甙和葡萄糖为底物，添加镁离子以及调节代谢物质，反应得到莱鲍迪甙A。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，基因工程菌的用量按湿菌体计为1~10g/L；葡萄糖的用量为20~120g/L；甜菊甙的用量为1~20g/L；所述的细胞通透剂为有机试剂，用量为0.2~10%；镁离子用量为1~l0g/L。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的调节代谢物质为柠檬酸钠，用量为0.5~10g/L。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的反应在磷酸钾缓冲液体系中完成，反应pH为6. 8~8.0，反应温度为25~42 ℃，反应时间为8~96h。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述有机试剂为表面活性剂或者螯合剂，所述表面活性剂为SDS、F~68或者Triton X~100，所述螯合剂为EDTA。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述SDS浓度为0.2~2%；F~68浓度0.5~2%，Triton X~100浓度0.5~2%， EDTA浓度0.2~2%。