[发明专利]一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法和应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：从UCSC Genome Browser下载PML和RARA基因探针所覆盖区域基因组非重复序列，再将分割后的序列批量导入OligoArray软件进行探针设计，然后将设计后的探针加上标签序列后直接合成，再使用带有荧光基团的标签引物对探针进行扩增和标记，得到PML/RARA融合基因快速检测探针。本发明制备所得PML/RARA融合基因快速检测探针具有杂交时间短(可在15～30分钟完成杂交实验)、杂交信号明亮、信噪比高、制备成本低等优点。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法和应用。

背景技术

检测PML/RARA融合基因是诊断急性早幼粒细胞白血病(APL)最特异最敏感的方法之一，也是APL治疗方案选择、疗效分析预后分析等最可靠的指标。目前核型分析、PCR法和FISH法是常见的几种检测方式。FISH具有安全、快速、灵敏度高及同时显示多种颜色等优点。

荧光原位杂交是一种在20世纪80年代放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性分子遗传技术，以荧光素标记取代放射性同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。目前FISH常用的检测探针主要是通过对特定人类基因组BAC克隆进行缺口平移法或随机引物法标记，再经COT-1DNA封闭后用于原位杂交实验，但此方法包含大量的重复序列即使经过COT-1DNA封闭但杂交结果仍具有较高的背景，并且此种方法标记的探针通常需要12-16h(过夜)来完成杂交实验费时费力并且此种方需要大量(通常是探针浓度的50～100倍)昂贵的COT-1DNA来进行重复序列封阻，这大大的增加了探针的制备成本。此外近年来一种不含重复序列的快速荧光原位杂交探针的制备方法也被建立起来(1h完成杂交实验)，但此种方法需要设计大量引物或者构建大量载体来实现探针的制备，并且探针的制备过程仍采用缺口平移或随机引物等传统方法，导致批次间的不稳定；此外此种制备方法仍然需要依赖于人类基因组序列或者BAC克隆序列，原料来源具有一定局限性，并且整个制备过程繁琐，制备成本和不可控因素大大增加。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)从UCSC Genome Browser下载PML和RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中PML探针覆盖区域为：chr15 74089693～74634008，RARA探针覆盖区域为：chr1738059674～38977709；

(2)将步骤(1)获得的PML基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的PML探针序列；

(3)将步骤(1)获得的RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端和3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的RARA探针序列；

(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得带有标签序列的PML探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到PML探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得带有标签系列的RARA探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到RARA探针库；