[发明专利]一种低成本的PML/RARA融合基因快速检测探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种低成本PML/RARA融合基因快速检测探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）从UCSC Genome Browser下载PML和RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列，其中PML探针覆盖区域为：chr15 74089693~74634008，RARA探针覆盖区域为：chr1738059674~38977709；

（2）将步骤（1）获得的PML基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray 软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端加上17bp的标签序列、3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的PML探针序列；所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85~99℃，GC比40~80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp；所述标签序列的碱基序列如下所示：5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG，3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG；

（3）将步骤（1）获得的RARA基因探针所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray 软件进行探针设计、探针筛选，然后将筛选出的探针导出到EXCEL表格中，再分别在每条探针的5’端加上17bp的标签序列、3’端加上18bp的标签序列，得到一系列带有标签序列的RARA探针序列；所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85~99℃，GC比40~80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5bp；所述标签序列的碱基序列如下所示：5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG，3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG；

（4）使用DNA合成仪对步骤（2）所得带有标签序列的PML探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到PML探针库；同理，使用DNA合成仪对步骤（3）所得带有标签序列的RARA探针序列进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到RARA探针库；

（5）分别合成5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物和5’端带有橘红色荧光基团的M13通用引物，使用5’端带有绿色荧光基团的M13通用引物对PML探针库进行扩增标记反应，使用5’端带有橘红色的荧光基团的M13通用引物对RARA探针库进行扩增标记反应；所述通用引物的序列如下所示：M13-F TGTAAAACGACGGCCAGT，M13-R CAGGAAACAGCTATGACC；

（6）将步骤（5）所得PML探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的PML探针库， 将步骤（5）所得RARA探针库的扩增标记产物纯化、稀释后即得到荧光标记的RARA探针库，所述荧光标记的PML探针库和荧光标记的RARA探针库构成了PML/RARA融合基因快速检测探针。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（5）所述扩增标记反应的PCR反应体系如下：

2×PCR Mix 25μL

模板 50ng

M13-F 1μL

M13-R 1μL

H₂O 补足至50μL。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（5）所述扩增标记反应的PCR反应条件如下：95℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，共进行35个循环；72℃10min。

4.一种包含权利要求1~3任一所述制备方法制备所得PML/RARA融合基因快速检测探针的PML/RARA融合基因试剂盒。

5.权利要求4所述试剂盒在制备用于检测PML/RARA融合基因产品中的应用。