[发明专利]一种靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒、构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术构建领域，具体涉及一种靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒、构建方法及应用。

背景技术

急性肝衰竭是由多种因素引起的严重肝脏损害，进而导致肝脏本身的合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍的一组临床综合征，其病因复杂，病情发展迅速，病死率极高(达80％)，目前尚缺乏特异的治疗手段。其主要病理变化是肝细胞的大量死亡。己发现，急性肝衰竭的肝细胞主要死亡形式之一是凋亡，急性肝衰竭的发生与肝细胞凋亡密切相关。细胞凋亡又称细胞的程序性死亡，是一个极其复杂、受基因精确调控的过程，在肝衰竭的发生、发展过程中起重要作用。近几年来，越来越多的肝衰竭中肝细胞凋亡相关因子被发现，其功能不断被研究。例如，已有研究发现TNF-α、TGF-β1、IGF-1、NGF过表达等均能诱导肝细胞大量凋亡，引发肝功能衰竭。尽管如此，肝衰竭发生机理到目前仍未完全阐明。因此，发现新的参与肝衰竭肝细胞凋亡的基因将于助于进一步了解肝衰竭发生机制，也为肝衰竭治疗提供新的靶标。我们在前期大鼠肝衰竭基因组学和肝再生基因组学研究中发现，磷脂酶Cγ2(phospholipase C gamma 2，PLCγ2)基因在整个肝衰竭发生过程中及肝损伤引起的肝再生后期表达均显著增强，系统生物学分析显示该基因可能与肝细胞凋亡有密切关系。

PLCγ2属于PLCγ亚家族成员之一，PLCγ2被激活后水解PIP2产生IP3和DAG，二者可分别通过诱发Ca²⁺信号途径和PKC信号途径，扳动一系列生理生化活动。PLCγ2通常被认为在炎症反应中起重要作用，近些年有研究发现，PLCγ2还参与细胞凋亡的调控。如Takatma等发现PLCγ2对细胞的生长起负调控效应，敲除该基因后DT40细胞株凋亡不能被诱导，若将cDNA重新转入该细胞中，凋亡即可恢复。张兵等发现活化的PLCγ2可通过PKCα信号通路诱导胃癌MGC80-3细胞的凋亡。

RNA干扰是一种重要的基因沉默手段，相比基因敲除，实验相对简单，筛选位点多，容易获得实验结果。相对于传统的反义核酸、核酶技术，该技术特异性高、技术流程设计更为简单易行，抑制基因表达的效果更为显著；疗效迅速且持续性较好。

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是基因转录后沉默的重要机制之一。虽然在哺乳动物细胞中siRNA能高效、特异性抑制基因的表达，但是人工合成RNA用一般的真核质粒载体进行转染的效率低，难以成为基因治疗药物，也很难实现基因干涉的目的。

为此，我们拟通过构建靶向大鼠磷脂酶Cγ2基因的shRNA干扰重组腺病毒以下调PLCγ2基因表达，观察抑制该基因表达对大鼠肝细胞凋亡的影响，以期为肝衰竭治疗提供新的靶标。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒、构建方法及应用，转染效率高，可以作为基因治疗药物，实现基因干涉。

本发明提供了一种大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒，靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒是将靶向大鼠磷脂酶Cγ2的寡核苷酸shRNA插入含有腺病毒基因组的骨架质粒pHBAd-BHG中后得到的，所述寡核苷酸shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种上述靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1，单链shRNA寡核苷酸的合成

步骤1.1，分别合成单链shRNA寡核苷酸的F序列和R序列；

其中，F序列为：

AATTCGCCAGCTTCGTGAGAAGATCATTCAAGAGATGATCTTCTCACGAAGCTGGCTTTTTTG；

R序列为：

GATCCAAAAAAGCCAGCTTCGTGAGAAGATCATCTCTTGAATGATCTTCTCACGAAGCTGGCG；

步骤2，重组穿梭质粒的构建和鉴定

步骤2.1，用EcoR I和BamH I双酶切穿梭载体pHBAd-U6-GFP，凝胶回收线性化的、长序列片段的空载体；

步骤2.2，将合成的F序列、R序列分别用1×TE稀释成浓度为1μg/1μL，得到F溶液和R溶液，然后将F溶液和R溶液退火，形成退火产物双链F/R；

步骤2.3，将步骤2.2中的双链F/R与步骤2.1中长序列片段的空载体连接，得到重组质粒pHBAd-PLCγ2shRNA；

步骤3，重组大鼠磷脂酶Cγ2腺病毒的构建