[发明专利]一种靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒、构建方法及应用

权利要求书

1.一种靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒，其特征在于，靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒是将靶向大鼠磷脂酶Cγ2的寡核苷酸shRNA插入含有腺病毒基因组的骨架质粒pHBAd-BHG中得到的，所述寡核苷酸shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1，单链shRNA寡核苷酸的合成

步骤1.1，分别合成单链shRNA寡核苷酸的F序列和R序列；

其中，F序列为：

AATTCGCCAGCTTCGTGAGAAGATCATTCAAGAGATGATCTTCTCACGAAGCTGGCTTTTTTG；

R序列为：

GATCCAAAAAAGCCAGCTTCGTGAGAAGATCATCTCTTGAATGATCTTCTCACGAAGCTGGCG；

步骤2，重组穿梭质粒的构建和鉴定

步骤2.1，用EcoR I和BamH I双酶切穿梭载体pHBAd-U6-GFP，凝胶回收线性化的、长序列片段的空载体；

步骤2.2，将合成的F序列、R序列分别用1×TE稀释成浓度为1μg/1μL，得到F溶液和R溶液，然后将F溶液和R溶液退火，形成退火产物双链F/R；

步骤2.3，将步骤2.2中的双链F/R与步骤2.1中长序列片段的空载体连接，得到重组质粒pHBAd-PLCγ2shRNA；

步骤3，靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒的构建

步骤3.1，将HEK293细胞接种于含10％FBS的DMEM完全培养液中，于5％CO₂、37℃环境中培养，当细胞密度达到70-80％时，重组质粒pHBAd-PLCγ2shRNA和骨架质粒pHBAd-BHG经转染试剂LipofiterTM介导，共转染HEK293细胞，得到细胞混合物；

步骤2.2，将所述细胞混合物接种于含10％FBS的DMEM完全培养液中，按“8”字形晃动，5％CO₂、37℃条件下培养，6h后更换新鲜的DMEM完全培养液，观察细胞出毒情况，当细胞渐成葡萄状并出现噬斑时，将从培养皿底部脱落的细胞收集至离心管中，离心管交替置于液氮和37℃水浴条件下冻融，然后离心，收集上清毒液，即得到Ad-PLCγ2shRNA第1代毒种P1；

步骤2.3，用第一代毒种P1感染密度为90％的HEK293细胞，收集第二代毒种P2；

步骤2.4，用第二代毒种P2感染密度为90％的HEK293细胞，收集第三代毒种P3，所述第三代毒种P3即为靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒。

3.一种如权利要求1所述的靶向大鼠磷脂酶Cγ2干扰重组腺病毒在抑制肝细胞增殖中的应用。